譚瑤 顏冰倩 艾雪峰 宮藝其 王會(huì)景 陳穎 劉明璐 徐徐 王偉 付煒

心血管疾病是目前威脅人類生命健康的主要疾病之一［1］。心肌細(xì)胞不具有再生能力，由于各種原因?qū)е碌乃劳龅男募〖?xì)胞將由瘢痕組織代替，失去正常的生理功能，最終導(dǎo)致心功能衰竭。對(duì)受損的心肌進(jìn)行細(xì)胞治療是目前研究的熱點(diǎn)。

干細(xì)胞來(lái)源廣泛，避免了利用成熟心肌細(xì)胞治療的來(lái)源和倫理問(wèn)題，成為細(xì)胞治療的重要來(lái)源。人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（Human induced pluripotent stem cell，hiPSC）是指將體細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞，來(lái)源廣，可實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療以避免不良免疫反應(yīng)［2-3］。目前已經(jīng)有較為成熟的分化體系，可將iPSC 誘導(dǎo)分化形成心肌細(xì)胞［4］。研究發(fā)現(xiàn)，在iPSC 心肌分化過(guò)程中，細(xì)胞轉(zhuǎn)化為高表達(dá)ISL1 的心肌前體細(xì)胞（Cardiac precursor cell，CPC）。這些ISL1＋CPC 能產(chǎn)生心臟主要的細(xì)胞群，包括心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等，研究認(rèn)為ISL1＋CPC 更適合作為心臟再生的細(xì)胞［5］。然而，目前iPSCs 衍生的心肌細(xì)胞較成人心肌細(xì)胞仍在形態(tài)和功能上具有較大差異［6］。

石墨烯及其衍生物因具有無(wú)可比擬的力學(xué)特性、優(yōu)異的導(dǎo)電性，表面積體積比大，能夠進(jìn)行化學(xué)修飾，成為近年來(lái)的研究焦點(diǎn)，并被廣泛應(yīng)用［7］。還原氧化石墨烯（Reduction of graphene oxide，rGO）是氧化石墨烯的還原形式，氧化基團(tuán)的去除使其導(dǎo)電性優(yōu)于氧化石墨烯；同時(shí)，還原氧化石墨烯擁有良好的生物相容性和低毒性［8］，有利于細(xì)胞黏附、增殖和分化［9］，使其成為組織工程一種良好的導(dǎo)電材料；此外，還原氧化石墨烯具有明顯的抗氧化作用［10］，能有效清除心肌損傷產(chǎn)生的活性氧。研究證明，rGO 具有明顯的抗菌作用，有利于減少手術(shù)后抗生素的使用［11］。這些良好的特性使其在神經(jīng)［12-13］、皮膚［14］、骨［15］、肌肉［16］等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。在心臟方面，Lee 等［17-18］在新生大鼠心臟注射含有rGO 的混合水凝膠，證明了rGO 作為一種導(dǎo)電材料可以促進(jìn)心肌細(xì)胞成熟。Stone 等［19］的研究證明了含有rGO 的聚酯酰胺能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化。

靜電紡絲技術(shù)是利用聚合物溶液或熔體在強(qiáng)電場(chǎng)中噴射紡絲，通過(guò)調(diào)節(jié)紡絲條件，結(jié)合不同的材料，制備出不同需求的靜電紡絲支架的一種技術(shù)，其制造設(shè)備簡(jiǎn)單、成本低、可紡材料種類繁多、工藝可控等優(yōu)點(diǎn)使之成為制備組織工程支架的重要手段之一［20］。特定排列的纖維絲對(duì)組織細(xì)胞排列具有一定的接觸導(dǎo)向作用［21］。心臟組織中特定的細(xì)胞排列方式有利于肌肉收縮以及同步電傳導(dǎo)［22］。研究已證明，靜電紡絲技術(shù)獲得的聚丙交酯-共-ε-己內(nèi)酯（PLCL）具有平行結(jié)構(gòu)的納米纖維，聯(lián)合成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)能夠促進(jìn)新生大鼠心肌細(xì)胞的成熟［23］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)靜電紡絲技術(shù)制備含有rGO 的有序PLCL 組織工程支架，對(duì)其表面結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)進(jìn)行表征，并初步探索其對(duì)hiPSC-CPC 增殖、形態(tài)以及心肌分化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

hiPSC 取自上海兒童醫(yī)學(xué)中心李彥欣教授課題組，為臍帶血細(xì)胞來(lái)源hiPSC。臍帶血捐獻(xiàn)者簽署了相關(guān)知情同意書。本研究經(jīng)上海兒童醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

相關(guān)設(shè)備：研磨儀（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）、泰斯曼高壓電源（大連泰思曼科技有限公司）、掃描電子顯微鏡（泰思肯有限公司）、X 射線衍射儀器（Brukeur 公司，德國(guó)）、倒置相差顯微鏡（Leica 公司，德國(guó)）、臺(tái)式單軸拉伸試驗(yàn)機(jī)（Instron 公司，美國(guó)）、XRD 衍射儀（Bruker 公司，美國(guó)）、絕緣導(dǎo)電靜電材料表面電阻測(cè)試儀（蘇州精格電子有限公司）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo 公司，美國(guó)）、激光共聚焦顯微鏡（Leica 公司，德國(guó)）、流式細(xì)胞分析儀（Beckman公司，美國(guó)）、酶標(biāo)儀（Thermo 公司，美國(guó)）、實(shí)時(shí)定量PCR 儀（Bio-Rad 公司，美國(guó)）。

相關(guān)試劑：rGO（昂星新型碳材料常州有限公司）、PLCL（濟(jì)南岱罡生物科技有限公司）、六氟異丙醇（百靈威科技有限公司）、TeSR-E8 培養(yǎng)基（Stemcell 公司，加拿大）、EDTA（Thermo 公司，美國(guó)）、Y-27632（Stemcell 公司，加拿大）、基質(zhì)膠（Corning 公司，美國(guó)）、PBS 緩沖液體（Hyclone 公司，美國(guó)）、Accutase 消化酶（Stemcell 公司，加拿大）、RPMI1640（Thermo 公司，美國(guó)）、減胰島素B27添加劑（Thermo 公司，美國(guó)）、CHIR99021（Stemcell公司，加拿大）、IWP-2（Stemcell 公司，加拿大）、B27添加劑（Stemcell 公司，加拿大）、心肌細(xì)胞消化液（北京賽貝生物技術(shù)公司）、Foxp3／轉(zhuǎn)錄因子染色緩沖液組（Invitrogen 公司，美國(guó)）、ISL1 抗體（DSHB 公司，美國(guó)）、肌鈣蛋白cTNT 抗體（Proteintech 公司，美國(guó)）、α-輔肌動(dòng)蛋白α-Actinin 抗體（Sigma-Aldrich公司，美國(guó)）、TRIZOL（Thermo 公司，美國(guó)）、CCK-8 增殖試劑盒（碧云天生物有限公司）、納米分光光度計(jì)（Thermo 公司，美國(guó)）、QuantiNova ? SYBR ? Green PCR 試劑盒（QIAGEN 公司，德國(guó)）、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa 公司，日本）。

1.2 材料制備與保存

PLCL 支架：PLCL 溶于六氟異丙醇，利用磁力攪拌器攪拌48 h，制備質(zhì)量體積比為7%的PLCL溶液。

rGO／PLCL 支架：rGO 是經(jīng)過(guò)化學(xué)還原的科研級(jí)別的化學(xué)還原氧化石墨烯。以六氟異丙醇作為溶劑，利用研磨儀60 Hz 分散rGO 制備成rGO 溶液。PLCL 溶于六氟異丙醇，利用磁力攪拌器攪拌48 h后，加入預(yù)配的rGO 溶液，配制成混合溶液：rGO／PLCL 質(zhì)量比為2%，PLCL 溶液質(zhì)量體積比為7%。

利用自制接收器通過(guò)靜電紡絲技術(shù)紡制有序靜電紡支架。紡絲電壓為10～11 kV，注射器容積為10 mL，待紡絲溶液5 mL，注射器推進(jìn)速度為1.5 mL／h，注射器與接收器之間的距離為8.5 cm，圓筒接收器轉(zhuǎn)速1 000 r／min，接收器表面覆蓋一層200 目的鐵絲網(wǎng)，紡絲濕度維持在30%～40%，溫度維持在25～30 ℃。所制備的材料保存于真空干燥箱中。

1.3 掃描電鏡檢測(cè)

將充分干燥的支架材料從真空干燥箱中取出，表面噴金后掃描電鏡觀察支架微觀結(jié)構(gòu)和表面形貌，最后利用Image J 軟件隨機(jī)選取200 個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)統(tǒng)計(jì)分析纖維的角度分布，繪制纖維角度分布圖；同時(shí)測(cè)量支架纖維直徑，并繪制材料直徑分布圖。

1.4 機(jī)械性能檢測(cè)

將兩組支架材料放入真空干燥箱中1 周，待充分干燥后，切割成30 mm×10 mm 的矩形，支架材料厚度為0.3～0.4 mm，使用臺(tái)式單軸拉伸試驗(yàn)機(jī)檢測(cè)支架力學(xué)性能。將材料固定于儀器上，以10 mm／min的速度記錄下應(yīng)力-應(yīng)變曲線，利用應(yīng)力-應(yīng)變曲線確定楊氏模量、斷裂點(diǎn)應(yīng)力和應(yīng)變極限值。將材料用蒸餾水充分浸泡后重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。每組測(cè)試3 個(gè)樣本。

1.5 成分檢測(cè)

通過(guò)X 射線衍射儀對(duì)材料進(jìn)行成分檢測(cè)。X射線衍射儀裝有0～115 °的CuKα 輻射源（λ ＝1.788 970 nm），用于監(jiān)測(cè)晶體狀態(tài)的變化。XRD工作參數(shù)：電壓40 kV，電流30 mA，步長(zhǎng)0.02 °。

1.6 導(dǎo)電性能檢測(cè)

將材料切割成40 mm×40 mm 的矩形，真空干燥后，通過(guò)絕緣導(dǎo)電靜電材料表面電阻測(cè)試儀采用四探針?lè)y(cè)定支架的電阻率，修正系數(shù)為23.76。

1.7 hiPSC 培養(yǎng)及鑒定［24］

將融合度達(dá)到80%～90% 的 hiPSC 用0.5 mmol／L的EDTA 消化5 min，2 00×g離心5 min后，用含有5 μmol／L Y-27632 的TeSR-E8 培養(yǎng)基按照1 ∶6～1 ∶8重懸并接種到6 孔板中（6 孔板事先用1 ∶70 稀釋的基質(zhì)膠室溫放置30 min 鋪板），于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中維持培養(yǎng)，每天更換TeSRE8 培養(yǎng)基，倒置相差顯微鏡觀察。

將完全貼壁的hiPSC 室溫下以4%多聚甲醛固定30 min，0.5% TritonX-100 室溫破膜30 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，添加所需的一抗Nanong／Sox2／Oct4／TRA-1-60（1 ∶200），4 ℃孵育過(guò)夜。PBS 清洗3 遍后，添加相應(yīng)熒光二抗（1 ∶1 000）室溫避光孵育2 h。DAPI（1 ∶1 000）室溫核染5 min，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.8 hiPSC 心肌分化及鑒定［24］

分化前，將490 mL RPMI1640 和10 mL 減胰島素的B27 補(bǔ)充物（50×）混合，制備分化培養(yǎng)基Ⅰ；將490 mL RPMI1640 和10 mL B27 補(bǔ)充物（50×）混合，制備分化培養(yǎng)基Ⅱ。待6 孔板中hiPSC 融合度達(dá)到80%～90%時(shí)，用Accutase 消化酶消化，200×g離心后，按12 孔板每孔1×106個(gè)hiPSC 重新種植，并在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h 至細(xì)胞鋪滿皿 底，將 TeSR -E8 換 成 添 加 12 μmol／L CHIR99021 的分化培養(yǎng)基Ⅰ，36 h 后，更換為分化培養(yǎng)基Ⅰ，1 d 后更換為含有5 μmol／L IWP-2 的分化培養(yǎng)基Ⅰ，分化第5 天更換為分化培養(yǎng)基Ⅰ。將分化至第6 天的細(xì)胞進(jìn)行心臟前體細(xì)胞ISL1 免疫熒光和流式細(xì)胞技術(shù)鑒定。自第7 天開始，更換為分化培養(yǎng)基Ⅱ，每2 天更換一次新培養(yǎng)基。第10 天以后，可以在平板上觀察到跳動(dòng)的心肌細(xì)胞。

將分化至第6 天的hiPSC-CPC 用Accutase 消化酶消化15 min 后，按1×105個(gè)／孔的細(xì)胞密度接種于預(yù)先鋪好基質(zhì)膠的24 孔板玻璃爬片上。待貼附完全后，室溫下4%多聚甲醛固定30 min，0.5%TritonX-100 室溫破膜30 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，添加心臟前體細(xì)胞標(biāo)志物ISL1 抗體（1 ∶200），4 ℃孵育過(guò)夜。PBS 清洗3 遍后，添加相應(yīng)熒光二抗（1 ∶1 000）室溫避光孵育2 h。DAPI（1 ∶1 000）室溫核染5 min，激光共聚焦顯微鏡觀察。

將分化至第6 天的 hiPSC -CPC 細(xì)胞用Accutase 消化酶消化15 min 后，添加 Foxp3／Transcription Factor Staining Buffer Set，冰上孵育30 min進(jìn)行固定破膜，添加心臟前體細(xì)胞標(biāo)志物ISL1 抗體冰上孵育30 min，添加相應(yīng)的熒光二抗（1 ∶1 000）冰上孵育30 min。流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行測(cè)定分析。

將分化的心肌細(xì)胞用心肌細(xì)胞消化液Ⅰ消化10 min，心肌細(xì)胞消化液Ⅱ消化20 min 后，按1×105個(gè)／孔的細(xì)胞密度接種于預(yù)先鋪好基質(zhì)膠的24 孔板玻璃爬片上。待貼附完全后，室溫下4%多聚甲醛固定30 min，0.5% TritonX-100 室溫破膜30 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，添加心肌細(xì)胞標(biāo)志物cTNT 抗體（1 ∶200），4 ℃孵育過(guò)夜。PBS 清洗3遍后，添加相應(yīng)熒光二抗（1 ∶1 000）室溫避光孵育2 h。DAPI（1 ∶1 000）室溫核染5 min，激光共聚焦顯微鏡觀察。

將分化的心肌細(xì)胞用心肌細(xì)胞消化液Ⅰ消化10 min，心肌細(xì)胞消化液Ⅱ消化20 min 后，添加Foxp3／Transcription Factor Staining Buffer Set，冰上孵育30 min 進(jìn)行固定破膜，添加帶有熒光標(biāo)記的心肌細(xì)胞標(biāo)志物cTNT 抗體冰上孵育30 min。利用流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行測(cè)定分析。

1.9 rGO／PLCL 有序支架對(duì)hiPSC-CPC 分化心肌細(xì)胞形態(tài)的影響

將支架材料剪裁成24 孔板大小，用75%乙醇浸泡30 min 消毒，PBS 清洗3 遍后，在1 ∶70 稀釋的基質(zhì)膠中室溫浸泡30 min 鋪膠備用。將分化第6 天的細(xì)胞種植在鋪好膠的有序支架上，繼續(xù)培養(yǎng)至出現(xiàn)跳動(dòng)心肌，室溫下4%多聚甲醛固定30 min，0.5%TritonX-100 室溫破膜30 min，5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，分別添加心肌細(xì)胞標(biāo)志物cTNT、肌動(dòng)蛋白α-Actin 抗體、4 ℃孵育過(guò)夜。PBS 清洗3 遍后，添加相應(yīng)熒光二抗（1 ∶1 000）室溫避光孵育2 h。DAPI（1 ∶1 000）室溫核染5 min，激光共聚焦顯微鏡觀察。用Image J 隨機(jī)取500 個(gè)統(tǒng)計(jì)點(diǎn)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的排列角度。用Image J 統(tǒng)計(jì)3 張不同視野的免疫熒光圖并計(jì)算短棒狀細(xì)胞占所有心肌細(xì)胞的比例。

1.10 rGO／PLCL 有序支架對(duì)hiPSC-CPC 分化心肌細(xì)胞增殖影響

將材料剪裁成24 孔板大小，用75%乙醇浸泡30 min 消毒，PBS 清洗3 遍后，在1 ∶70 稀釋的基質(zhì)膠中室溫浸泡30 min 鋪膠備用。將分化第6 天的hiPSC-CPC 種植在鋪好膠的有序支架上，分別在接種后第1、4、7 天利用CCK-8 試劑盒對(duì)細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行測(cè)定。每組3 個(gè)重復(fù)樣本。

1.11 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)

應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)心肌相關(guān)基因的表達(dá)。收集支架上的分化至第15 天的心肌細(xì)胞，加入Trizol 提取總RNA。RNA 的濃度和純度通過(guò)納米分光光度計(jì)進(jìn)行驗(yàn)證。用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用QuantiNova ?SYBR? Green PCR 試劑盒在實(shí)時(shí)定量PCR 儀上擴(kuò)增和檢測(cè)。每組3 個(gè)樣本，每個(gè)樣本3 個(gè)重復(fù)加樣檢測(cè)，收集每個(gè)樣本3 個(gè)重復(fù)的平均循環(huán)閾值（Ct）值，以內(nèi)源性對(duì)照18S 標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)結(jié)果，依據(jù)2-△△Ct計(jì)算RNA 相對(duì)表達(dá)量（表1）。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 熒光定量PCR 引物序列Table 1 Fluorescent quantitative PCR primer sequences

2 結(jié)果

2.1 電紡膜制備及表面形態(tài)

在靜電紡絲接收器上覆蓋一層200 目的鐵絲網(wǎng)，將配制的聚合物溶液通過(guò)高壓噴射在接收器上形成有序支架。用于靜電紡絲的PLCL 溶液呈均勻無(wú)色透明，添加rGO 的溶液呈黑色均質(zhì)狀。紡制形成的含rGO／PLCL 支架呈灰色，未添加rGO 的PLCL支架呈白色。掃描電鏡下兩組支架材料整體呈現(xiàn)疏松多孔結(jié)構(gòu)，纖維細(xì)絲光滑筆直，排列有序，PLCL支架纖維分布在0.6～2.7 μm，80%的纖維分布在1.5～2.1 μm，rGO／PLCL 支架纖維分布在0.3～2.1 μm，80%的纖維分布在0.9～1.5 μm。PLCL 支架和rGO／PLCL 支架纖維角度分布在10 °以內(nèi)者分別占54%和58%，兩種材料纖維均有90%分布在40 °以內(nèi)（圖1）。

圖1 電紡膜制備及表面形態(tài)Fig.1 Preparation and surface morphology of electrospun scaffolds

2.2 靜電紡絲支架材料鑒定

兩組支架在干燥情況下，根據(jù)拉伸試驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制應(yīng)力-應(yīng)變曲線，曲線均近似正比關(guān)系，達(dá)到最大形變后發(fā)生斷裂。楊氏模量分別為（2.82±0.10）MPa 和（0.49±0.03）MPa，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）；最大應(yīng)變分別為280.10%±6.80%和462.70%±46.04%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；最大應(yīng)力分別為（7.89±0.10）MPa 和（2.31±0.01）MPa，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）。兩組支架在濕潤(rùn)情況下，楊氏模量分別為（2.20±0.03）MPa 和（0.63±0.05）MPa，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）；最大應(yīng)變分別為318.70%±17.53%和384.3%±24.34%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；最大應(yīng)力分別為（6.67±0.15）MPa 和（2.42±0.33）MPa，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.000 1）。利用XRD 對(duì)PLCL 支架、rGO／PLCL 支架、rGO（未進(jìn)行靜電紡絲）進(jìn)行成分檢測(cè)。PLCL 和rGO／PLCL 支架在16.5 °顯示出PLCL 的特征峰，rGO／PLCL 支架特征峰的峰高度大于PLCL 支架。未進(jìn)行靜電紡絲的單純r(jià)GO 在23 °顯示出rGO 的特征峰。對(duì)材料的電阻率進(jìn)行測(cè)定，PLCL 支架電阻率達(dá)到400 GΩ，而rGO／PLCL 支架電阻率僅為0.075 GΩ（圖2）。

圖2 PLCL、rGO／PLCL 支架材料鑒定Fig.2 Identification of PLCL scaffolds and rGO／PLCL scaffolds

2.3 hiPSC 鑒定

hiPSC 呈克隆樣生長(zhǎng)，細(xì)胞排列緊密，邊緣清晰光滑，細(xì)胞較小，圓形，核質(zhì)比高，細(xì)胞核顯著。免疫熒光鑒定可以觀察到高表達(dá)多能性標(biāo)志物Oct4、TRA-1-60、Sox2、Nanong（圖3）。

2.4 hiPSC 心肌分化及鑒定

通過(guò)添加CH99021 和IWP-2 誘導(dǎo)iPSC 向心肌細(xì)胞分化，分化過(guò)程中細(xì)胞發(fā)生形態(tài)變化，iPSC逐漸變?yōu)樗缮E圓形的心肌前體細(xì)胞，隨著分化的進(jìn)行，細(xì)胞逐漸變成多形性的心肌細(xì)胞形態(tài)，在第6天細(xì)胞高表達(dá)心臟前體細(xì)胞標(biāo)志物ISL1，陽(yáng)性率為74.7%；并在第10 天開始出現(xiàn)散在自發(fā)搏動(dòng)點(diǎn)并逐漸連成整層細(xì)胞片跳動(dòng)。分化到第30 天，細(xì)胞形態(tài)清晰，呈多形性，具有明顯的肌節(jié)結(jié)構(gòu)，雙核心肌細(xì)胞較多，高表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)志物cTNT，陽(yáng)性率為72.3%（圖4）。

2.5 rGO／PLCL 對(duì)hiPSC-CPC 心肌分化的影響

圖3 iPSC 細(xì)胞特異性標(biāo)志物鑒定Fig.3 Pluripotency identification of hiPSC

如圖5 所示，將hiPSC 分化的心臟前體細(xì)胞重新接種到PLCL、rGO／PLCL 支架上，繼續(xù)培養(yǎng)至第15 天，免疫熒光鑒定結(jié)果提示兩組支架材料上的細(xì)胞高表達(dá)心肌細(xì)胞標(biāo)志物α-Actin、cTNT，細(xì)胞排列方向與支架纖維排列方向具有一致性。對(duì)細(xì)胞長(zhǎng)軸與支架纖維長(zhǎng)軸形成的夾角進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，兩組支架上均有90%以上的細(xì)胞在30 °以內(nèi)，10 °范圍內(nèi)的細(xì)胞分別為69%和68%。心肌細(xì)胞能夠被有序支架引導(dǎo)。對(duì)分化的短棒狀的心肌細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，rGO／PLCL 約有45%的細(xì)胞呈現(xiàn)短棒狀形態(tài)，顯著高于PLCL 組的20.1%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），更趨近于成熟細(xì)胞棒狀的形態(tài)。CCK8 增殖實(shí)驗(yàn)提示PLCL 和rGO／PLCL 支架材料上的CPC 在接種后7 d 內(nèi)均有增殖能力，分化前期rGO／PLCL 上細(xì)胞增殖效率稍高于PLCL 組，后期rGO／PLCL 上細(xì)胞增殖效率稍低于PLCL 組，但兩組的增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。qPCR 結(jié)果提示，rGO／PLC 組中與肌節(jié)成熟相關(guān)基因CTNT、MYH7／MYH6 的表達(dá)高于PLCL 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與細(xì)胞間通信相關(guān)的連接蛋白CX43 的表達(dá)高于PLCL 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 iPSC 細(xì)胞心肌分化及鑒定Fig.4 Identification of iPSC cells and myocardial differentiation

2.6 rGO／PLCL 對(duì)hiPSC-CPC 心肌分化基因水平上的影響

對(duì)CPC 細(xì)胞、兩組支架材料上的心肌細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq 分析。主成分分析提示，CPC 細(xì)胞和支架材料上心肌細(xì)胞分群明顯，而PLCL 和rGO／PLCL支架材料上心肌細(xì)胞差異較小。差異基因統(tǒng)計(jì)分析顯示，CPC 分化至心肌細(xì)胞，基因發(fā)生顯著變化；PLCL 支架材料與rGO／PLCL 支架材料上的心肌細(xì)胞之間差異較小，差異基因主要為下調(diào)基因。對(duì)這些差異基因進(jìn)行聚類分析，在細(xì)胞成分層面，靶基因主要富集于細(xì)胞外空間和細(xì)胞外區(qū)域等GO 條目中；在分子功能層面，靶基因主要富集于鈣離子結(jié)合和細(xì)胞外基質(zhì)組成等GO 條目中；在生物過(guò)程層面，靶基因主要富集于細(xì)胞黏附和細(xì)胞外基質(zhì)排列等GO 條目中（圖6）。

3 討論

細(xì)胞治療為心肌損傷提供了新的治療方案。心臟祖細(xì)胞作為種子細(xì)胞具有巨大的治療潛力。hiPSC 來(lái)源的心臟祖細(xì)胞由于來(lái)源廣泛，避免了倫理問(wèn)題，成為了心肌損傷細(xì)胞治療的理想種子細(xì)胞來(lái)源。干細(xì)胞分化來(lái)源的心肌細(xì)胞較成人心肌細(xì)胞在形態(tài)和功能上仍具有較大差異。目前的許多研究致力于利用模擬天然心臟環(huán)境的生物材料使干細(xì)胞具有更好的應(yīng)用潛能［25］。

圖5 有序rGO／PLCL 支架材料對(duì)iPSC-CPC 心肌分化的影響Fig.5 Effect of aligned rGO／PLCL scaffolds on differentiation of iPSC-CPC

本實(shí)驗(yàn)利用靜電紡絲技術(shù)制備出有序rGO／PLCL 支架，有序的表面結(jié)構(gòu)引導(dǎo)細(xì)胞排列，模擬正常心肌組織中心肌細(xì)胞的排列方式；工程化支架為貼附其上的心肌細(xì)胞提供了更接近于生理組織的機(jī)械支撐；導(dǎo)電材料rGO 的添加為種植于其上的細(xì)胞提供了更理想的分化環(huán)境。

圖6 rGO／PLCL、PLCL 支架上心肌細(xì)胞的RNA-seq 分析Fig.6 RNA-seq analysis of cardiomyocytes on RGO／PLCL and PLCL scaffolds

利用靜電紡絲技術(shù)紡制出的rGO／PLCL 支架纖維排列具有一致性，種植于其上的hiPSC-CPC 分化形成的心肌細(xì)胞在纖維上排列有序，有明顯導(dǎo)向作用。Nunes 等［26］認(rèn)為有序排列的細(xì)胞有利于心肌細(xì)胞間電傳導(dǎo)，促進(jìn)心肌細(xì)胞的同步收縮。在材料的紡制中，rGO 的添加使支架纖維直徑顯著降低。Ramazani 等［27］認(rèn)為這是由于射流中積聚的電荷的強(qiáng)烈排斥作用在rGO 表面產(chǎn)生了大量的負(fù)電荷，從而使停留在接收器上的纖維絲具有更小的直徑。以往的研究認(rèn)為，這種更細(xì)的纖維絲基底能夠通過(guò)增加孔隙率促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)黏附［28］。同時(shí)，rGO 的添加增加了支架材料的應(yīng)變能力，最大可擴(kuò)增至462%，有利于心肌組織更好的收縮舒張。添加rGO 后，支架的彈性模量下降至（0.49±0.03）MPa（干燥）和（0.63±0.05）MPa（濕潤(rùn)）。而心肌的剛度在舒張開始時(shí)為10～20 kPa，在舒張末期為200～500 kPa［29-30］，剛度在數(shù)十千帕到大約1 兆帕的材料是心臟應(yīng)用的最佳選擇［31］。rGO 的加入使支架接近于正常心肌的力學(xué)性能，為心肌分化提供了更接近于生理組織的機(jī)械支撐。此外，導(dǎo)電性能測(cè)定結(jié)果提示，rGO 的添加極大降低了支架的電阻率，為hiPSC-CPC 心肌分化提供了更加良好的電生理環(huán)境，為心肌細(xì)胞之間同步電傳導(dǎo)和肌肉收縮提供了更有利的環(huán)境，有助于心肌分化［19］。通 過(guò) 在rGO／PLCL支架上接種hiPSCCPC，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)形成的心肌細(xì)胞中有更多的細(xì)胞趨近于成熟細(xì)胞短棒狀的形態(tài)；同時(shí)，心肌細(xì)胞肌節(jié)相關(guān)標(biāo)志物CTNT、MYH7／MYH6 的表達(dá)升高提示rGO 的添加有助于肌節(jié)的發(fā)育；此外，rGO／PLCL 支架上連接蛋白CX43 也呈現(xiàn)更高的表達(dá)，CX43 通常在心臟相鄰心肌細(xì)胞間盤處觀察到，它們促進(jìn)電流流動(dòng)，協(xié)調(diào)心肌細(xì)胞收縮以維持其泵功能［32］，它的升高提示rGO 有助于細(xì)胞間的通信和連接。但這些基因在整個(gè)RNA-seq 分析中變化差異較小，rGO 的添加僅僅促使小部分基因發(fā)生顯著變化。綜上，通過(guò)改變電生理環(huán)境在一定程度上促進(jìn)了hiPSC-CPC 細(xì)胞分化成熟，如果能結(jié)合一定的電刺激，使支架材料提供的電生理環(huán)境發(fā)揮更顯著的作用，可進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的活動(dòng)，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟。