周夢 余菲 邵春益 傅瑤

角膜內(nèi)皮是位于角膜和前房房水間的單層細胞結(jié)構(gòu)，它的泵功能和屏障功能對維持角膜的透明起著至關(guān)重要的作用［1-2］。角膜內(nèi)皮細胞在人體內(nèi)維持終身無復(fù)制狀態(tài)，當臨床上的常見疾病如大泡性角膜病變、Fuch 角膜變性等使得細胞數(shù)量低于臨界值時，會引起患者角膜水腫，嚴重時損傷視功能［3］。目前，此類疾病主要的治療方法仍然是穿透性角膜移植手術(shù)或角膜內(nèi)皮移植，但供體角膜的缺乏限制了移植手術(shù)的開展。在角膜替代組織缺乏的現(xiàn)狀下，組織工程角膜受到了廣泛的關(guān)注，種子細胞、生物相容性佳的載體、利于細胞生長的環(huán)境是組織工程角膜主要的三個因素，而在這其中，獲得足夠量的種子細胞是至關(guān)重要的一環(huán)。內(nèi)皮祖細胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）是一種來源于成人外周血和骨髓的干細胞，作為分化為成熟血管內(nèi)皮細胞的中間狀態(tài)，其在心血管疾病領(lǐng)域被廣泛研究［4］。內(nèi)皮祖細胞可在體外大量獲得和增殖，是組織工程種子細胞的理想來源，近年來也被用于角膜組織工程研究［5］。PAX6 基因在正常的人眼球發(fā)育過程中具有非常重要的作用，參與細胞的增殖、遷移和分化等過程，與角膜細胞的功能密切相關(guān)［6］。本研究通過觀察大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞在轉(zhuǎn)染PAX6 基因后向角膜內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)分化的過程，探討其作為組織工程角膜種子細胞的可能性。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑和儀器

4 只雌性4 周齡SD 大鼠（上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院SPF 級動物中心）。本研究符合動物實驗倫理原則。本研究中病毒轉(zhuǎn)染部分由吉滿生物科技（上海）有限公司進行。

EMG-2（Lonza 公司，瑞士），Histopaque（Sigma-Aldrich 公司，美國），纖連蛋白（BioSource 公司，美國），5% Donkey Serum（Jackson 公司，美國），CD31、CD34、CD133 一 抗（Santa Cruz 公 司，美 國），Dil-AcLDL（Invitrogen 公司，美國），F(xiàn)ITC-UEA-1（Sigma-Aldrich 公司，美國），DAPI（Vector Labs 公司，美國），BCA 蛋白定量試劑盒（Thermo Scientific 公司，美國），5%脫脂牛奶（北京索萊寶科技有限公司），PAX6、GAPDH 一抗（武漢愛博泰克生物科技有限公司），mRNA 提取試劑盒（上海奕杉生物科技有限公司）。

臺式大容量離心機（Eppendorf 公司，德國），細胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific 公司，美國），超純水儀（Milli-Q Reference，美國），蛋白電泳儀（北京博泰斯生物技術(shù)有限公司），蛋白顯影儀（上海天能科技有限公司），紫外／可見分光光度計（NanoDrop 公司，美國），PCR 儀（T3 thermeter 公司，美國），熒光正置顯微鏡（Olympus 公司，日本），制冰機（Scotsman，意大利）。

1.2 大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞的分離和培養(yǎng)

取4 周齡雌性SD 大鼠，在無菌操作臺中獲取脛腓骨。用無菌1 mL 注射器抽取EMG-2 培養(yǎng)液沖洗兩端關(guān)節(jié)的骨髓腔直至骨干變白，吸管吹打混勻后將用培養(yǎng)液稀釋的骨髓腔細胞移至15 mL 離心管中，小心加入同體積的Histopaque（1.083 g／mL）密度梯度離心液，400×g、30 min、速度梯度模式離心。離心后的液體分為4 層，從上而下分別為培養(yǎng)液、磨砂色單核細胞層、透明Histopaque 液、紅細胞層。用吸管小心伸入第二層磨砂色單核細胞層，盡可能將細胞吸盡，并置入新的50 mL 離心管中，加入同體積PBS 沖洗，之后250 g、10 min 離心后棄上清液，重復(fù)沖洗一次，盡量洗盡Histopaque 液。使用含10%FBS 的EGM-2 培養(yǎng)液重懸細胞，接種于纖連蛋白鋪層的3.5 cm 培養(yǎng)皿，置入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。第4 天全換液，之前保持細胞皿靜置，換液時將未貼壁的細胞洗去，之后每兩天觀察細胞狀態(tài)，細胞融合達80%時進行傳代，傳代比例為1 ∶3。

1.3 大鼠內(nèi)皮祖細胞鑒定

將原代培養(yǎng)至第4 天的內(nèi)皮祖細胞接種于鋪有細胞爬片的24 孔板中，待細胞融合近80%時用4%多聚甲醛室溫下固定細胞1 h，PBS 清洗3 遍后用含5% Donkey Serum 的PBS 室溫下封閉1 h，PBS 清洗3 遍，用含2%體積的CD31、CD34、CD133 的封閉液（即一抗）在4 ℃環(huán)境下孵育過夜。PBS 清洗3 遍后使用相應(yīng)的二抗室溫下孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

取原代培養(yǎng)至第4 天的內(nèi)皮祖細胞，吸出培養(yǎng)液，PBS 清洗細胞后加入含2 μL Dil-AcLDL 的200 μL細胞培養(yǎng)液，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h。之后使用10%多聚甲醛室溫下固定15 min，PBS 清洗2 遍，加入含2 μL FITC-UEA-1 的200 μL 培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱孵育2 h。DAPI 染細胞核10 min，PBS清洗2 遍。熒光顯微鏡下觀察，表達紅綠藍3 種熒光的為陽性細胞。

1.4 PAX6 基因的轉(zhuǎn)染

取第一代狀態(tài)良好的內(nèi)皮祖細胞接種于3.5 cm培養(yǎng)皿中，待細胞融合近80%時進行病毒轉(zhuǎn)染。裝載GFP-PAX6（Ad-PAX6）的腺病毒作為實驗組，空載組作為對照組（Ad-GFP）。吸出培養(yǎng)液后，用PBS 清洗2 遍，加入含0.01%（體積分數(shù)）病毒的細胞培養(yǎng)液進行病毒轉(zhuǎn)染，6 h 后觀察細胞形態(tài)，熒光顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染效率。

1.5 免疫印跡實驗（Western blot）

1.5.1 提取細胞蛋白質(zhì)

以每3.5 cm 培養(yǎng)皿100 μL 的比例配制適量蛋白裂解液RIPA（含1%蛋白酶抑制劑），置于冰上預(yù)冷備用。從培養(yǎng)箱中取出待提取蛋白的細胞培養(yǎng)皿，吸去培養(yǎng)液，預(yù)冷的PBS 清洗2 遍，加入預(yù)冷的蛋白裂解液，使用蛋白刮沿皿底刮除1 遍，后置于冰上裂解10 min，重復(fù)2 次。超聲波徹底裂解蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒定量蛋白濃度。

1.5.2 免疫印跡實驗

以每孔25 μg 蛋白的濃度加樣，選取12%的SDS-PAGE 膠，先設(shè)置80 V 進行電泳，待蛋白壓成統(tǒng)一直線后加到120 V 電泳，直至跑出目的條帶，轉(zhuǎn)膜。室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST 清洗3 遍至無封閉液殘留，加入PAX6 和GAPDH 一抗4 ℃孵育過夜。TBST 清洗3 遍，加入種屬相符的二抗室溫下孵育1 h，TBST 清洗3 遍，蛋白顯影儀上進行顯影。

1.6 角膜內(nèi)皮細胞特征性基因檢測

1.6.1 提取細胞mRNA

全過程使用mRNA 提取試劑盒。從培養(yǎng)箱中取出待提取蛋白的細胞培養(yǎng)皿，吸去培養(yǎng)液，PBS 清洗2 遍。每孔加入500 μL 裂解緩沖液，置于冰上裂解5 min，加入500 μL 無水乙醇，吸管反復(fù)吹打后移入試劑盒中附有的提取柱中。12 000×g離心1 min，倒出廢液，加入500 μL 洗滌液，清洗2 遍，加入20 μL洗脫緩沖液，12 000×g離心1 min 得到mRNA提取液。使用TaKaRa 試劑盒（寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）反轉(zhuǎn)錄mRNA 為cDNA，先測得mRNA 的濃度，根據(jù)濃度加入各種成分試劑，于機器中設(shè)置好反轉(zhuǎn)錄的3 個過程及溫度時長，待過程結(jié)束后獲得cDNA。

1.6.2 實時熒光定量PCR

Pubmed 基因庫中設(shè)計AQP-1、ZO-1、ATP1A1、SNAI1、SNAI2 共5 種mRNA 的引物（AQP-1：ACCTGCT GGCCATTGACTAC，CCAGGGCACTCCCAATGAAT；ZO-1：CGCTAAAGGGAGGAAGTTGTGA，CCAGGTTG GAGGAAGCAGAAA；ATP1A1：AAGAACCCAAACGCA TCGGA，TTGCCGTGGAGGAGGATAGA；SNAI1：AGT TGTCTACCGACCTTGCG，TGCAGCTCGCTATAGTTGG G；SNAI2：CCTCATCTTTGGGGCGTGTA，ATGGCATG GGGGTCTGAAAG），使用轉(zhuǎn)染空載組病毒的細胞作為對照組，轉(zhuǎn)染PAX6 基因的細胞作為實驗組，各組加入5 種目的基因的引物，并以GAPDH 引物作為內(nèi)參進行校準。上機選擇程序，得到原始循環(huán)數(shù)后使用ΔΔCt 值作圖。

1.7 統(tǒng)計學分析

上述實驗均重復(fù)3 次以上，每次實驗均包含3個平行組。使用Prism 8 軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠內(nèi)皮祖細胞的細胞形態(tài)和增殖情況

大鼠內(nèi)皮祖細胞原代取材后接種細胞皿中12 h后即有細胞貼壁，形態(tài)為橢圓形，散落于皿底各處，有的細胞可形成放射狀的生長形態(tài)。4 d 后，細胞克隆數(shù)增加，形態(tài)多呈短梭形，與周圍纖維細胞形態(tài)形成明顯差異。8 d 后，細胞密度增大，形態(tài)趨于橢圓形，開始形成相互間的連接，克隆直徑明顯增加。12 d 后，克隆直徑進一步增大，細胞趨近鋪路石樣，形態(tài)飽滿，相互之間緊密鑲嵌。培養(yǎng)2 周后細胞可長滿培養(yǎng)皿，此時可進行細胞傳代，傳代后的細胞形態(tài)與傳代時的接種密度相關(guān)，密度過低會使得細胞纖維化（圖1）。

圖1 大鼠內(nèi)皮祖細胞培養(yǎng)過程Fig.1 Culture process of rat endothelial progenitor cells

2.2 大鼠內(nèi)皮祖細胞的鑒定

大鼠內(nèi)皮祖細胞接種于培養(yǎng)皿第4 天，內(nèi)皮祖細胞特異表達CD31、CD34、CD133。另外，Dil-AcLDL 染色呈紅色，表明細胞可攝取AcLDL，F(xiàn)ITCUEA-1 染色呈綠色，雙染色陽性的細胞從功能學方面被認定為EPCs。結(jié)合上述結(jié)果可表明此種方法培養(yǎng)出的細胞為大鼠內(nèi)皮祖細胞（圖2）。

2.3 PAX6 基因的轉(zhuǎn)染和基因表達情況

在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的內(nèi)皮祖細胞，選取多個視野。無論在空載組還是過表達PAX6 組中，相差顯微鏡下所呈現(xiàn)的細胞基本呈現(xiàn)綠色熒光，表明細胞轉(zhuǎn)染效率均達到95%以上。免疫印跡實驗結(jié)果也與熒光染色結(jié)果一致，在過表達PAX6 組GAPDH 條帶較淺的情況下（即過表達PAX6 組蛋白總量較少），空載組PAX6 蛋白幾乎無表達。結(jié)果表明PAX6 成功轉(zhuǎn)染大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞（圖3）。

2.4 角膜內(nèi)皮細胞特征性基因檢測

如圖4 所示，AQP-1、ZO-1、ATP1A1 是3 種代表角膜內(nèi)皮細胞屏障功能和泵功能的基因，這3 種基因在轉(zhuǎn)染PAX6 基因的內(nèi)皮祖細胞中表達均比空載組明顯增多（P＜0.05），表明過表達PAX6 基因的骨髓內(nèi)皮祖細胞有向角膜內(nèi)皮細胞分化的趨勢。SNAI1、SNAI2 是2 種纖維化相關(guān)的基因，內(nèi)皮細胞對于此種結(jié)締組織標志性基因呈低表達水平，這2種基因在轉(zhuǎn)染PAX6 基因的內(nèi)皮祖細胞中表達均比空載組明顯減少（P＜0.05）。

圖2 內(nèi)皮祖細胞標志物熒光染色Fig.2 Fluorescence staining of endothelial progenitor cell markers

圖3 內(nèi)皮祖細胞轉(zhuǎn)染PAX6 基因Fig.3 Endothelial progenitor cells transfected with PAX6 gene

圖4 角膜內(nèi)皮細胞標志物mRNA 表達水平Fig.4 mRNA expression level of corneal endothelial cell markers

3 討論

人角膜內(nèi)皮細胞在體內(nèi)保持終生無復(fù)制狀態(tài)，常見的大泡性角膜內(nèi)皮病變及遺傳性的Fuch 角膜營養(yǎng)不良會使得角膜內(nèi)皮功能性失代償，引起視力模糊乃至視力喪失，目前的最終治療方案仍然是角膜移植［1-3］。近年來，角膜移植手術(shù)量雖然呈逐年增長趨勢，但依舊受限于角膜供體不足。構(gòu)建組織工程角膜為解決這一問題提供了新的可能性。

干細胞具有自我更新能力和多向分化的潛能，是組織工程種子細胞的理想選擇。內(nèi)皮祖細胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）由Asahara 等［7］于1997 年首次提出，作為血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，除參與胚胎組織的生成外，還代表一群可分化為多種組織內(nèi)皮細胞的干細胞。EPCs 與造血干細胞共同起源于胚外中胚層，胎兒肝臟是臍血EPCs 最主要的來源，成人外周血和骨髓是成人體內(nèi)EPCs的主要來源［8］。正常情況下，EPCs 數(shù)量較少，需要通過相應(yīng)的篩選方法富集，常用的有密度梯度離心法和免疫磁珠法，本研究結(jié)合前期研究基礎(chǔ)，采用成熟的密度梯度離心法培養(yǎng)大鼠內(nèi)皮祖細胞。

內(nèi)皮祖細胞的鑒定表型目前還存在諸多爭議。單獨從形態(tài)學上（形成短梭狀或類鋪路石樣的細胞）鑒別缺乏堅實的證據(jù)，需輔以進一步的表型特征加以區(qū)別。CD34 為Asahara 等［7］首次分離外周血內(nèi)皮祖細胞使用的特征分子，然而由于成熟的內(nèi)皮細胞同樣表達CD34，因此單獨的CD34 陽性不具備特異性。Peichev 等［8］在CD34陽性細胞的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了CD133 的表型特異性，因為成熟的內(nèi)皮細胞不表達CD133，因此可作為祖細胞的特征性分子。此外，Dil-AcLD 和FITC-UEA-1 表達雙陽性可在功能學上被認定為內(nèi)皮祖細胞［9］。本研究結(jié)合CD31、CD34、CD133、ac-LDL、UEA-1 染色來鑒定大鼠內(nèi)皮祖細胞。結(jié)果表明，本研究中培養(yǎng)的細胞大量表達內(nèi)皮祖細胞特異蛋白，可被認定為是大鼠內(nèi)皮祖細胞。

PAX6 基因最初在研究WAGR 綜合征時被發(fā)現(xiàn)。隨后，Ton 等［10］在先天性無虹膜患者中發(fā)現(xiàn)此基因的缺失突變。之后大量的研究表明，PAX6 基因在正常的人眼球發(fā)育過程中起非常重要的作用，參與細胞的增殖、遷移和分化等過程，這些活動與角膜細胞的功能密切相關(guān)［11-13］。2014 年，Ouyang等［14］發(fā)現(xiàn)WNT7A 和PAX6 對角膜上皮細胞的活動至關(guān)重要。2020 年，Yu 等［15］通過研究發(fā)現(xiàn)角膜內(nèi)皮細胞在損傷后PAX6 基因表達明顯升高，并通過SUMO 化修飾調(diào)控其功能。因此，我們推測PAX6 基因?qū)悄?nèi)皮細胞的分化可能產(chǎn)生相應(yīng)的影響。本研究證實，轉(zhuǎn)染PAX6 基因的大鼠骨髓內(nèi)皮祖細胞表達AQP-1、ZO-1、ATP1A1 等功能性基因，并下調(diào)纖維化基因的表達，呈現(xiàn)向角膜內(nèi)皮細胞分化的趨勢。

本研究通過培養(yǎng)骨髓內(nèi)皮祖細胞，并使之過表達PAX6 基因，可誘導(dǎo)其向角膜內(nèi)皮細胞分化，為組織工程角膜種子細胞體外來源不足提供了具有潛力的解決方案，也為角膜移植的進一步發(fā)展提供了新的可能性。