吳 迪,謝春娥,李 峰1，,王允亮,薛曉軒,袁亞利1,,王乾皓1,,焦 瑤1,,李軍祥,楊晉翔

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029；3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078)

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) 首先排除酒精及其他明確損肝因素，與肥胖、胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、遺傳易感等多種因素有關(guān)，其臨床病理特征表現(xiàn)以肝實質(zhì)細胞脂肪變性為主，是一種多系統(tǒng)受累的代謝性疾病，如心腦血管疾病、2型糖尿病等疾病的發(fā)生發(fā)展均與其有關(guān)[1]。目前NAFLD已經(jīng)成為全球常見的慢性肝病，有研究發(fā)現(xiàn)我國的發(fā)病率為20.09%，隨著大家對身體健康的重視，該疾病已經(jīng)得到大眾的密切關(guān)注[2-3]。1998年Marshall[4]提出了“腸-肝軸”的概念，肝臟70%的血供來源于門靜脈，當(dāng)腸黏膜屏障受損，腸內(nèi)細菌、內(nèi)毒素等通過門靜脈進入肝臟，引起炎性因子的釋放，促進氧化應(yīng)激及胰島素抵抗的發(fā)生，損傷肝臟，“腸-肝軸”在這一過程中起重要作用[5-6]。目前，針對腸道黏膜屏障、腸道菌群及代謝產(chǎn)物與NAFLD發(fā)病關(guān)系的研究已經(jīng)成為熱點話題。本課題組前期臨床研究中發(fā)現(xiàn)茵陳苓桂劑可以改善非酒精性脂肪性肝炎患者肝功能和減少肝臟脂肪含量[7]，本研究從“腸-肝軸”和腸黏膜屏障功能的角度進一步探討了茵陳苓桂劑治療 NAFLD 的作用機制，為中醫(yī)藥防治NAFLD提供更多依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1動物 SPF級雄性SD大鼠60只，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2016-0002，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。

1.2藥物 茵陳苓桂劑由茵陳蒿、梔子、大黃、茯苓、桂枝、白術(shù)、甘草、絞股藍、水飛薊組成，購于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院顆粒藥房。多烯磷脂酰膽堿，賽諾菲安萬特(北京)制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20059010。給藥劑量根據(jù)大鼠與人的體表面積等效劑量比值進行折算。

1.3主要試劑與儀器 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)試劑盒(南京建成)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)試劑盒(上海酶聯(lián))，內(nèi)毒素(LPS)試劑盒(prospec，ANT-130)，ZO-1抗體 (Santa cruz，SC- 8146)，Occludin 抗體(Abcam，ab31721)，CD14抗體(prospec，ANT-251)，TLR4抗體(Santa cruz，ab13867)；Rm-2235石蠟切片機(德國萊卡公司)，NIKON Eclipse ci顯微鏡(日本)，全自動生化分析儀(日立，7600)，EG1150H包埋機(德國萊卡公司)，酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)，3K18離心機(sigma)，Multiskan MK3，電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國BIO-RAD)。

1.4分組、造模及干預(yù) 從60只SD大鼠中隨機取10只作為對照組，給予普通飼料喂養(yǎng)；其余大鼠給予高脂飼料[78.8%基礎(chǔ)飼料、10%蛋黃粉、10%豬油、1%膽固醇、0.2%膽酸鈉，購于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，許可證號：SCXK(京)2015-0015]喂養(yǎng)建立NAFLD模型，喂養(yǎng)8周后隨機抽取2只大鼠，肝臟病理學(xué)分析證實造模成功后，將大鼠隨機分為5組，茵陳苓桂劑高、中、低劑量組及多烯磷脂酰膽堿組各10只，模型組8只。茵陳苓桂劑高、中、低劑量組給予19.6 g/kg、9.8 g/kg、4.9 g/kg茵陳苓桂劑灌胃，多烯磷脂酰膽堿給予0.15 g/kg多烯磷脂酰膽堿灌胃，對照組和模型組給予等體積的蒸餾水灌胃，均1次/d，連續(xù)4周。

1.5標(biāo)本采集 大鼠干預(yù)結(jié)束后禁食24 h，腹腔注射麻醉，其中茵陳苓桂劑中劑量組的2只大鼠因不耐受麻醉而死亡。腹主動脈取血，分別離心取血清、血漿，剖腹取出肝臟和回腸末端組織，部分組織置于4%的多聚甲醛液中固定，另外部分-80 ℃冰箱凍存。

1.6觀察指標(biāo)與檢測方法

1.6.1組織病理學(xué)觀察 取肝臟、回腸末端組織，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片等操作后，進行HE染色并觀察組織病理表現(xiàn)。

1.6.2血液學(xué)指標(biāo)檢測 用全自動生化分析儀檢測血清AST、ALT、TG、TC水平，用ELISA法檢測血清TNF-α、IL-6水平，用鱟試劑盒檢測血漿LPS水平，所有操作均按照試劑盒說明書進行。

1.6.3回腸組織中TLR4及CD14蛋白表達Western blot檢測 取回腸組織，剪碎后加入組織蛋白提取試劑，勻漿、離心，取上清蛋白溶液，采用BCA法測定蛋白濃度，取蛋白40 μL 進行SDS-PAGE電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入封閉液室溫封閉2 h后加入一抗，4 ℃搖床過夜，用TBST洗膜后，加入二抗室溫孵育1 h，再次TBST洗膜，最終采用增強化學(xué)發(fā)光法(ECL) 曝光檢測，最后采用凝膠分析軟件分析目標(biāo)，用目的蛋白灰度值與β-肌動蛋白(β-actin)灰度值的比值表示蛋白的相對表達量。

1.6.4回腸組織中ZO-1、Occludin表達免疫組織化學(xué)檢測 取回腸組織，常規(guī)固定后制成石蠟切片，再經(jīng)過脫蠟、復(fù)水、修復(fù)、封閉，加入一抗、二抗，接著進行DAB顯色、復(fù)染、脫水封片等常規(guī)操作后，顯微鏡下采集圖片進行免疫陽性結(jié)果的判斷，用平均光密度值表示ZO-1、Occludin的表達強度。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)比較 對照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞形態(tài)未見明顯異常，無脂肪變、氣球樣變、炎細胞浸潤及壞死；模型組大鼠肝細胞出現(xiàn)脂肪變、氣球樣變，有炎細胞浸潤和少許點狀壞死，可見胞質(zhì)內(nèi)圓形空泡，肝小葉結(jié)構(gòu)異常；各給藥組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)、肝細胞脂肪變、脂滴空泡、壞死及炎細胞浸潤均較模型組有不同程度的改善。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織HE染色鏡下表現(xiàn)(×200)

2.2各組大鼠回腸組織病理學(xué)表現(xiàn)比較 對照組大鼠末端回腸組織腸上皮結(jié)構(gòu)完整、排列緊密，未見上皮細胞脫落壞死，黏膜層腸絨毛排列有序，固有層腸腺豐富，杯狀細胞較多，無炎細胞浸潤；模型組大鼠末端回腸組織可見腸上皮結(jié)構(gòu)不完整，上皮細胞脫落，部分腸絨毛疏松，腸腺、杯狀細胞數(shù)量減少，結(jié)締組織增生，伴有淋巴細胞浸潤；與模型組相比，各給藥組大鼠腸上皮結(jié)構(gòu)基本完整，偶有少量上皮細胞脫落，固有層腸腺豐富，杯狀細胞增多，炎細胞浸潤不同程度減少。見圖2。

圖2 各組大鼠回腸組織HE染色鏡下表現(xiàn)(×200)

2.3各組大鼠血清生化指標(biāo)比較 模型組大鼠血清 ALT、AST、TC、TG水平均明顯高于對照組(P均<0.05)。多烯磷脂酰膽堿組與茵陳苓桂劑高、中劑量組大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平和茵陳苓桂劑低劑量組大鼠血清AST、TC水平均明顯低于模型組(P均<0.05)；茵陳苓桂劑高劑量組血清AST水平明顯低于茵陳苓桂劑中劑量組(P<0.05)，血清ALT、TC、TG水平明顯低于茵陳苓桂劑低劑量組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清生化指標(biāo)水平比較

2.4各組大鼠血清TNF-α、IL-6及血漿LPS水平比較 模型組大鼠血清TNF-α、IL-6及血漿LPS水平均明顯高于對照組(P均<0.05)。茵陳苓桂劑高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6及血漿LPS水平和茵陳苓桂劑中劑量組血清IL-6水平均明顯低于模型組(P均<0.05)；茵陳苓桂劑高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6及血漿LPS水平與其他給藥組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6及血漿LPS水平比較

2.5各組大鼠回腸組織中TLR4及CD14蛋白表達情況 模型組大鼠回腸組織中TLR4、CD14蛋白相對表達量均明顯高于對照組(P均<0.05)；各給藥組大鼠回腸組織中TLR4、CD14蛋白相對表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，但各組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖3及表3。

表3 各組大鼠回腸組織中TLR4、CD14蛋白相對表達量比較

A為對照組；B為模型組；C為茵陳苓桂劑高劑量組；D為茵陳苓桂劑中劑量組；E為茵陳苓桂劑低劑量組；F為多烯磷脂酰膽堿組圖3 各組大鼠回腸組織中TLR4、CD14蛋白表達情況

2.6各組大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin蛋白表達情況 光鏡下觀察到對照組大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin蛋白陽性表達較多，陽性表達染色主要為棕褐色，模型組大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin蛋白陽性表達減少，而各給藥組ZO-1、Occludin蛋白陽性表達較模型組增多，見圖4。模型組大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin蛋白表達平均光密度值明顯低于對照組(P均<0.05)；茵陳苓桂劑高劑量組大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin蛋白表達平均光密度值均明顯高于模型組(P均<0.05)，各給藥組間ZO-1、Occludin蛋白表達平均光密度值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表4。

表4 各組大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin平均光密度值比較

圖4 各組大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin蛋白表達免疫組化染色表現(xiàn)(×200)

3 討 論

NAFLD的發(fā)病機制比較復(fù)雜，其中腸黏膜屏障功能與該病的關(guān)系已經(jīng)被大家重視。腸內(nèi)菌群在人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)中相互依存和制約才能達成生態(tài)平衡，與腸道黏膜結(jié)合后參與機體物質(zhì)代謝，腸道正常生理功能和機體免疫也正是依賴這種平衡。腸道和肝臟在結(jié)構(gòu)和功能上具有一定內(nèi)在聯(lián)系，具有相同的胚胎學(xué)起源-前腸，二者又共同參與機體免疫功能，構(gòu)筑起牢固的防御系統(tǒng)[8-9]。在腸、肝防御系統(tǒng)中，腸道屏障作為第一道防線阻擋有害物質(zhì)(細菌、毒素)通過門靜脈進入肝臟，腸黏膜內(nèi)的淋巴細胞還可以游離于兩臟參與免疫調(diào)節(jié)；而肝臟是機體重要的免疫器官，在防御系統(tǒng)中是機體的第二道防線[10-11]。

腸黏膜機械屏障在腸道屏障中極其重要，是由腸道黏膜上皮細胞、細胞間緊密連接等構(gòu)成，其中緊密連接發(fā)揮著關(guān)鍵作用，主要包括結(jié)構(gòu)蛋白咬合蛋白(occludin)、閉合蛋白(claudin)家族以及功能蛋白帶狀閉合蛋白(ZO)家族等，它們共同完成腸黏膜屏障功能，從而阻擋腸內(nèi)細菌、內(nèi)毒素、炎癥因子等有害物質(zhì)對肝臟的損害[12]。如果腸肝循環(huán)中腸黏膜屏障被打破，會導(dǎo)致腸源性LPS進入血液[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者血液中LPS含量明顯增加[14]。進入肝臟的LPS超過肝臟清除能力時，便可以通過與細胞膜表面的特異性受體進入肝細胞，直接造成損傷；Toll樣受體4(TLR4) 是LPS最主要模式識別受體，LPS/TLR4信號途徑在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[15]。LPS首先與脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)結(jié)合, 然后再與KC表面的細胞膜受體CD14結(jié)合，形成LPS-LBP-CD14復(fù)合物，進而激活TLR4蛋白的表達，此過程產(chǎn)生大量的細胞因子及炎癥介質(zhì)，可放大免疫炎癥反應(yīng)，加重肝臟損傷[16-19]。

中醫(yī)學(xué)將NAFLD歸為“癥瘕”“積聚”“肝痞”“脅痛”“痰濁”“肥氣”等范疇?！案尾嵠ⅰ崩碚撌滓娪凇峨y經(jīng)》“見肝之病，則知肝當(dāng)傳之于脾，當(dāng)先實其脾氣，無令受肝之病邪”，張仲景在《金匱要略》也有記載：“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實脾。”中醫(yī)學(xué)對于肝脾相互影響早有深刻的認識?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)“腸”的功能相當(dāng)于“脾”，“脾主運化”，“脾為之衛(wèi)”，維持機體正常的消化、吸收、代謝及抵御外邪的功能。NAFLD病因病機多與外感寒邪、過食肥甘、勞逸失常、情志失調(diào)等有關(guān)，病位在肝，與脾有關(guān)，脾的運化正常有利于肝的疏泄功能發(fā)揮，肝脾失調(diào)，運化、疏泄失常會導(dǎo)致氣、血、水代謝失調(diào)[20]。茵陳苓桂劑組成主要來源于《傷寒論》中的苓桂術(shù)甘湯和茵陳蒿湯，茵陳蒿、梔子、大黃、茯苓、桂枝、白術(shù)、絞股藍、水飛薊等共奏溫化痰濁、清利濕熱、祛除瘀結(jié)之效，使脾氣健旺，肝膽疏泄正常，恢復(fù)氣、血、水的正常運化。

本實驗研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肝臟和回腸組織可見明顯病理損傷，血清ALT、AST、TC、TG、TNF-α、IL-6及血漿LPS水平和回腸組織中TLR4、CD14蛋白相對表達量均較對照組明顯增高，回腸組織中ZO-1、Occludin平均光密度值均較對照組明顯降低，提示NAFLD大鼠存在肝臟和回腸損傷；多烯磷脂酰膽堿組與茵陳苓桂劑高、中劑量組大鼠血清ALT、AST、TC、TG水平和茵陳苓桂劑低劑量組大鼠血清AST、TC水平均明顯低于模型組，且茵陳苓桂劑高劑量組血清AST水平明顯低于茵陳苓桂劑中劑量組，血清ALT、TC、TG水平明顯低于茵陳苓桂劑低劑量組；茵陳苓桂劑高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-6及血漿LPS水平和茵陳苓桂劑中劑量組血清IL-6水平均明顯低于模型組；各給藥組大鼠回腸組織中ZO-1、Occludin蛋白陽性表達均高于模組組，TLR4、CD14蛋白相對表達量均低于模型組；茵陳苓桂劑高劑量組大鼠回腸組織中ZO-1和Occludin蛋白表達平均光密度值均高于模型組。說明茵陳苓桂劑可以調(diào)節(jié)NAFLD大鼠脂代謝，通過修復(fù)腸道緊密連接，靶向調(diào)控LPS/TLR4信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，維持正常腸道黏膜屏障功能，阻止腸內(nèi)炎癥因子、內(nèi)毒素等進入肝臟，提示茵陳苓桂劑治療NAFLD作用機制與調(diào)節(jié)腸-肝軸、改善腸道機械免疫屏障有關(guān)。

本研究從腸-肝軸理論、腸黏膜屏障功能及中醫(yī)學(xué)“肝病實脾”的角度出發(fā)，探討了茵陳苓桂劑防治NAFLD的作用機制，不僅能體現(xiàn)中醫(yī)藥治療的特色，還能通過中西醫(yī)相結(jié)合的理論探討疾病的治療效果，然而中醫(yī)藥的優(yōu)勢在于多靶點的治療，所以還需拓展研究思路及視野為茵陳苓桂劑的臨床應(yīng)用提供更多的客觀依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。