張繼華，張皓蕾，劉玲玲，王 燕，王 來

(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院，河北 石家莊 050031)

人參皂甙Rg3是一種新近研究發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤中藥單體，其有抑制腫瘤細胞增殖、分裂、局部浸潤及遠處轉(zhuǎn)移等作用[1]，但其具體作用機制尚不明確。在惡性腫瘤局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移過程中，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化起著重要作用，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程是由多個信號傳導途徑觸發(fā)和調(diào)控的，這些信號途徑能夠?qū)毎獾拇碳ぎa(chǎn)生應答而被激活，其中TGF-β途徑被認為是最重要的途徑之一[2-3]。以往研究表明，SIX1同TGF-β相互作用能促進多種惡性腫瘤細胞淋巴結的轉(zhuǎn)移[4]，但具體作用機制以及對惡性腫瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響尚不明確，三者在人喉鱗癌中的相互作用仍少見報道。本研究通過培養(yǎng)原代人喉鱗癌細胞，觀察了人參皂甙Rg3在抑制人喉鱗狀細胞癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用，并以SIX1、TGF-β為切入點，探討其具體的作用機制，為人喉鱗狀細胞癌的臨床治療提供理論參考。

1 實驗材料與方法

1.1實驗細胞 取術中留存的人喉鱗狀細胞癌組織，河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院耳鼻咽喉實驗室自行原代細胞培養(yǎng)。

1.2藥物 Rg3(20R，標準品，中國藥品生物制品檢定所，樣品批號：110804-200301，樣品純度98%)，使用前應用二甲基亞砜(DMSO)助溶，抽慮方法除菌后-20 ℃冰箱保存。順鉑(注射用，凍干型，齊魯制藥有限公司出品，產(chǎn)品批號：04090251)，試驗前用0.9%氯化鈉注射液配成相應濃度，-20 ℃冰箱保存。

1.3試劑 SIX1免疫組化用多克隆抗體，武漢博士德公司，工作濃度為1∶75。TGF-β免疫組化用多克隆抗體，武漢博士德公司，工作濃度均為1∶55。E-cadherin免疫組化用多克隆抗體，北京奧維亞生物技術有限公司，工作濃度為1∶50。免疫組化用SP染色試劑盒、DAB顯色用試劑，北京中杉金橋公司。轉(zhuǎn)染用SIX1和TGF-β試劑盒，美國Invitrogen公司。

1.4主要儀器 GeneAmp PCR system9600儀(美國Perkin Elmer公司)，二氧化碳MCO175型培養(yǎng)箱(日本三洋公司)，潔凈工作臺JJT-2型(北京半導體設備廠)，倒置相差顯微鏡CX-PC-2型(日本OLYMPUS公司)，GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)(美國UVP)。

1.5實驗方法

1.5.1原代人喉鱗癌細胞培養(yǎng) 手術留取人喉鱗癌組織，置4 ℃的0.9%氯化鈉注射液中無菌保存，留取的組織塊盡快轉(zhuǎn)移至實驗室超凈臺，進行如下處理并原代細胞培養(yǎng)：修剪留取新鮮、正常腫瘤組織，慶大霉素殺菌處理15 min，0.9%氯化鈉注射液沖洗2次，將組織塊剪碎(初步使組織塊分離成單細胞)，慶大霉素液沖洗2次，0.9%氯化鈉注射液沖洗2次，加入I型膠原酶消化1 h，每間隔10 min進行1次吹打混合，促進喉癌組織塊分解成單個腫瘤細胞。消化結束后，0.9%氯化鈉注射液沖洗細胞混合液2次，加入細胞培養(yǎng)液，內(nèi)含20%胎牛血清，將細胞懸濁液接種于6孔滅菌細胞培養(yǎng)板，上述接種的細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱，常規(guī)培養(yǎng)48 h。取出培養(yǎng)板，培養(yǎng)孔內(nèi)加入消化用胰蛋白酶，利用雜質(zhì)細胞(成纖維細胞為主)與喉鱗癌腫瘤細胞對胰蛋白酶消化作用不同而出現(xiàn)不同細胞脫離培養(yǎng)板底壁時間差異，去除雜質(zhì)細胞。反復進行上述純化，直至得到純化的腫瘤細胞。待其穩(wěn)定傳代后，對培養(yǎng)細胞進行鑒定(2名副高以上職稱病理科醫(yī)生共同鑒定)并確認為鱗癌細胞后，擴增細胞，進行試驗。

1.5.2試驗細胞分組 原代人喉鱗癌細胞分為對照組、順鉑組、Rg3組。順鉑組人喉鱗癌細胞內(nèi)加入順鉑，使其終濃度為3 μg/mL；Rg3組人喉鱗癌細胞內(nèi)加入Rg3，使其終濃度為300 μg/mL(參考文獻[5]，順鉑3 μg/mL與Rg3 300 μg/mL對人喉鱗癌細胞的抑制率無差異)。處理后繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h，收集、處理、備用。

1.5.3SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表達免疫組織化學法檢測 消化原代人喉鱗癌細胞，用細胞培養(yǎng)液配制細胞懸液，使其濃度為1×105個/mL， 取24孔細胞培養(yǎng)板，板內(nèi)置已滅菌玻璃片，每組設6孔，向孔內(nèi)的滅菌玻璃片上接種腫瘤細胞，每孔接種上述細胞懸液1滴。培養(yǎng)板轉(zhuǎn)移入細胞培養(yǎng)箱，常規(guī)培養(yǎng)4 h，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，待玻璃片上細胞達80%以上已經(jīng)貼壁，向培養(yǎng)板每孔內(nèi)加約1 mL DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)板內(nèi)腫瘤細胞已達80%～90%%匯合，取出培養(yǎng)板，PBS溶液沖洗1次，甲醛溶液固定10 min，PBS溶液沖洗2次，每次5 min。留取玻璃片上爬片細胞，參照免疫組化試劑盒說明，進行爬片細胞免疫熒光染色，蓋玻片封存，鏡檢。 結果判斷采用半定量雙評分法，倒置熒光顯微鏡高倍鏡視野下根據(jù)陽性細胞所占比例以及細胞綠色熒光強度進行綜合判定。表達強度評分標準：未見熒光或者僅見極弱熒光， 記0分；熒光微弱但明顯可見，記1 分；熒光可見且光色明亮，記2分；熒光可見且光色閃亮， 記3分。高倍鏡下視野內(nèi)陽性細胞比例：陽性細胞比例<25%，記0分；陽性細胞比例25%～50%，記1分；陽性細胞比例51%～75%，記2分；陽性細胞比例>75%，記3分。兩種方法所得評分和0～1分為目的蛋白陰性(-)，2 分為目的蛋白弱陽性(+)，3～4分為目的蛋白陽性()，5～6分為目的蛋白強陽性()。

1.5.4SIX1、TGF-β和E-cadherin蛋白表達Western blot檢測 參照試劑盒說明書，提取樣本蛋白，制備Western blot檢測樣品，檢測各組樣品蛋白濃度，常規(guī)上樣，配制選用12%分離膠以及4%濃縮膠，每組樣品上樣量65 μg，同時設置Marker預染蛋白，100 V電泳約1 h 25 min，轉(zhuǎn)膜30 V，0.9 mA過夜。洗膜，定影后進行圖像分析。

1.5.5SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA表達RT-PCR檢測 Trizol法提取樣本腫瘤細胞總的RNA，檢測各組樣本細胞濃度，確定樣本細胞RNA完整，cDNA反轉(zhuǎn)錄合成，取轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL進行PCR反應。GAPDH：上游5’-GAC AGT CAG CCG CAT CTTCT-3’，下游5’-TTA AAA GC AGC CCT GGT GAC-3’；SIX1：上游5’-CCACTAGAAGAGGAATT-3’，下游5’-CACGCCGGAGCCAAACT-3’，產(chǎn)物大小254 bp，退火溫度56.3 ℃；TGF-β：上游5’-CTGTAATTCTGCTGTAATA-3’，下游5’-GGCTTAGTATTCTGGGAAA-3’，產(chǎn)物大小287 bp，退火溫度54.2 ℃；E-cadherin：上游5’-AGGCCAAGCAGCAGTACATT-3’，下游5’-ATTCACATCCAGCACATCCA-3’，產(chǎn)物大小為288 bp，退火溫度為56.6 ℃。反應條件：94 ℃變性1 min，57 ℃復性1 min，75 ℃延伸1 min，共設計32個循環(huán)，最后設計75 ℃延伸10 min。以GAPDH的熒光表達量作為檢測基因表達參照量。

2 結 果

2.13組人喉鱗癌細胞中SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表達免疫組化染色表現(xiàn) 對照組SIX1、TGF-β蛋白強陽性表達，E-cadherin蛋白弱陽性表達；順鉑組SIX1和E-cadherin蛋白陽性表達，TGF-β蛋白強陽性表達； Rg3組SIX1蛋白弱陽性表達，E-cadherin和TGF-β蛋白強陽性表達。見圖1。

圖1 3組人喉鱗癌細胞中SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表達免疫組化染色表現(xiàn)(×200)

2.23組人喉鱗癌細胞中SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表達水平 順鉑組及Rg3組SIX1蛋白表達水平均明顯低于對照組(P均<0.05)，且Rg3組明顯低于順鉑組(P<0.05)；順鉑組及Rg3組E-cadherin蛋白表達水平均明顯高于對照組(P均<0.05)，且Rg3組明顯高于順鉑組(P<0.05)； 3組間TGF-β蛋白表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 各組人喉鱗癌細胞中SIX1、TGF-β及E-cadherin蛋白表達水平比較

2.33組人喉鱗癌細胞中SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA表達情況 順鉑組及Rg3組SIX1 mRNA表達水平均明顯低于對照組(P均<0.05)，且Rg3組明顯低于順鉑組(P<0.05)；順鉑組及Rg3組 E-cadherin mRNA表達水平均明顯高于對照組(P均<0.05)，且Rg3組明顯高于順鉑組(P<0.05)； 3組間TGF-β mRNA表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表2及圖2。

圖2 3組人喉鱗癌細胞中SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA表達情況

表2 各組人喉鱗癌細胞中SIX1、TGF-β及E-cadherin mRNA表達水平比較

3 討 論

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指腫瘤上皮細胞在一定的環(huán)境及相應轉(zhuǎn)化因子等共同因素的相互影響下逐步轉(zhuǎn)變成間質(zhì)細胞的現(xiàn)象，是惡性腫瘤細胞生長、轉(zhuǎn)變的過程之一，同惡性腫瘤細胞的局部浸潤及遠處淋巴結轉(zhuǎn)移緊密相關。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程主要表現(xiàn)為原腫瘤上皮細胞極性逐漸消失，上皮細胞與其周圍其他細胞的接觸相應減少，細胞間的連接包括黏附連接及緊密連接減少，使得細胞脫離的機會增加，易于發(fā)生局部浸潤及發(fā)生遠處遷移，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生會出現(xiàn)原有上皮細胞表型的轉(zhuǎn)變，其上皮表型如E- eadherin、角蛋白絲等消失，間質(zhì)表型、纖維連接蛋白、N-鈣黏素等逐漸形成。其中代表細胞間黏附力的E-cadherin表達下降是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要表現(xiàn)，也被視為上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標志[6]。相關實驗研究表明，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化可誘導多種惡性腫瘤細胞如卵巢癌、肝癌、結腸癌及惡性黑色素瘤等局部浸潤和淋巴轉(zhuǎn)移[7-10]。因此，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化被認為是多種惡性腫瘤轉(zhuǎn)移潛能的標志。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程是由多個信號傳導通路觸發(fā)和調(diào)控的，TGF-β能夠通過MAPK通路、SMAD通路及Wnt通路等途徑對腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移進行調(diào)節(jié)，在多種腫瘤組織如肺癌、乳腺癌、大腸癌等中均存在TGF-β的高表達，其表達強度與腫瘤的病理分化、淋巴轉(zhuǎn)移及預后密切相關[11-12]。TGF-β能夠被細胞中的多種活性因子激活，并與這些因子共同作用，激活及影響細胞內(nèi)多種傳導通路，但腫瘤細胞中轉(zhuǎn)錄因子的高表達能否增強TGF-β途徑在誘導人喉鱗癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的作用尚不清楚。

SIX1是一種成熟相關的細胞因子，在發(fā)育成熟的細胞內(nèi)很少表達，但其在多種惡性腫瘤如卵巢癌、乳腺癌、肝細胞癌等組織中呈現(xiàn)出高表達，能夠影響Cyclin A1、Cyclin D1及Ezrin 等多種下游編碼基因的表達，與腫瘤的預后密切相關[13-15]。最近研究證明，SIX1 能夠與TGF-β共同作用，并通過SMAD2/3途徑調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等多種基因的表達，進而發(fā)揮其促進腫瘤細胞淋巴結轉(zhuǎn)移的功能?；谝陨涎芯拷Y果，本研究探討了SIX1與TGF-β是否在人喉鱗癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程中起著促進作用。

本實驗結果顯示，順鉑組及Rg3組人喉鱗癌細胞中SIX1蛋白及其mRNA表達較對照組明顯下調(diào)，E-cadherin蛋白及其mRNA表達較對照組明顯上調(diào)，TGF-β蛋白及其mRNA表達無明顯變化，說明順鉑及Rg3能夠通過抑制人喉鱗癌細胞中SIX1的表達，進一步抑制喉鱗癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Sun等[16]的研究結果顯示，TGF-β能夠通過SMAD2/3途徑促進卵巢癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，而此過程是SIX1依賴性的，SIX1表達降低能夠抑制TGF-β促卵巢癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生，SIX1蛋白的表達同E-cadherin表達呈負相關。本研究結果與之相似，推測TGF-β能夠通過SMAD2/3途徑促進喉鱗癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生，這一過程亦是SIX1依賴性的。本研究還發(fā)現(xiàn)，Rg3組人喉鱗癌細胞中SIX1蛋白及其mRNA表達水平明顯低于順鉑組， E-cadherin蛋白及其mRNA表達水平明顯高于順鉑組，提示Rg3抑制人喉鱗細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用強于順鉑，其原因可能同Rg3有更強的抑制喉鱗癌細胞內(nèi)SIX1表達作用有關。

綜上所述，人參皂甙Rg3能夠通過下調(diào)SIX1表達起到抑制人喉鱗癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，且作用強于順鉑，其可以作為抑制喉癌淋巴轉(zhuǎn)移的一個新型用藥，但Rg3抑制腫瘤細胞內(nèi)SIX1表達及SIX1、TGF-β與E-cadherin之間的具體作用機制尚待進一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。