張 凡，王星星，朱新景，景慧玲,王綰江

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽 712000；2. 陜西省西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710016)

銀屑病是一種常見的易于反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥性皮膚病，病程長，可累及皮膚、毛發(fā)、指趾甲等部位，臨床表現(xiàn)多種多樣，主要表現(xiàn)為瘙癢、鱗屑和紅斑，可并發(fā)自身免疫病、代謝綜合征、心血管疾病、腫瘤及心理、精神類疾病[1]。銀屑病的治療尚未有明確的特效藥，主要是使用免疫抑制劑、皮質(zhì)類激素和維A酸類等，但是不能長期使用，且治療效果因人而異。中醫(yī)認為銀屑病是由于素體血中蘊熱，復(fù)感風(fēng)熱毒邪，或恣食腥發(fā)動風(fēng)之物，或情志內(nèi)傷，五志化火，兩陽相合，內(nèi)不能疏泄，燔灼血液，充斥肌膚，“血分有熱”是銀屑病的主要發(fā)病原因，清熱涼血法是治療銀屑病的主要方法。紫草首載于《神農(nóng)百草經(jīng)》，具有清熱解毒、涼血止血、透疹發(fā)斑作用[2]，是治療銀屑病的常用藥物之一，既可單味藥使用，又可與其他藥物配伍使用，既能內(nèi)治又可外用，臨床療效肯定。紫草素是紫草的主要有效成分，現(xiàn)代藥理研究認為紫草素具有抗炎、抗腫瘤、抗過敏的作用[3-5]，但其治療銀屑病的作用機制尚不明確。本研究主要探討紫草素通過調(diào)節(jié)皮膚基底的RAS含量干預(yù)Hippo-YAP 信號通路達到抗銀屑病的作用。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 25只SPF級BALB/C雄性小鼠，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，由三峽大學(xué)提供，動物許可證號：SYXK(鄂)2017-0012。小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物實驗中心，室溫 22 ℃，整個實驗期間允許動物自由采食、飲水，定期更換墊料，并給予12 h光照/12 h 黑暗循環(huán)。

1.2試劑與儀器 紫草素(Sigma，貨號：S7576)； 5%咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字H20030128)；凡士林(上海澤葉生物科技有限公司)；IL-17、IL-22、TNF-αELISA試劑盒(伊萊瑞特)；蘇木素(Sigma，貨號：H9627)；伊紅Y(水溶性)(國藥集團，貨號：71014544)； Trizol(Ambion)；HiScript Reverse Transcriptase (RNase H)(VAZYME)；5×HiScript Buffer(VAZYME)； Ribonuclease Inhibitor(TransGen)；dNTP(TIANGEN)；50×ROX Reference Dye 2(VAZYME)；SYBR Green Master Mix(VAZYME)；Taq Plus DNA Polymerase(TIANGEN)；DL2000 DNA Marker(TIANGEN)；Random Primer(N6)(TAKARA)。病理切片機，切片刀，組織攤烤片機，顯微鏡，離心機，電熱恒溫培養(yǎng)箱，F(xiàn)lexStation 3多功能酶標(biāo)儀，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，實時熒光定量PCR儀，熒光定量PCR管，PCR儀，紫外分析儀。

1.3分組、造模及干預(yù) 取BALB/C雄性小鼠25只，隨機分為正常組、模型組、紫草素高濃度組、紫草素中濃度組、紫草素低濃度組，每組5只。小鼠戊巴比妥(80 mg/kg)腹腔注射麻醉，背部剃毛面積約3 cm×5 cm。正常組：每日定時在小鼠裸露處皮膚均勻涂抹純凡士林，1次/d，連續(xù)7 d；模型組：外涂5%咪喹莫特乳膏，1次/d，42 mg/次，連續(xù)7 d；紫草素高濃度組：外涂5%咪喹莫特乳膏，1次/d，42 mg/次，同時給予80 mg/(kg·d)紫草素混懸液灌胃，連續(xù)7 d；紫草素中濃度組：外涂5%咪喹莫特乳膏，1次/d，42 mg/次，同時給予40 mg/(kg·d)紫草素混懸液灌胃，連續(xù)7 d；紫草素低濃度組：外涂5%咪喹莫特乳膏，1次/d，42 mg/次，同時給予20 mg/(kg·d)紫草素混懸液灌胃，連續(xù)7 d。

1.4觀察指標(biāo)與方法

1.4.1體征觀察 用數(shù)碼相機記錄每組小鼠的皮損變化，采用PASI評分標(biāo)準(zhǔn)對各組小鼠相應(yīng)紅斑、鱗屑及浸潤程度進行評分(0分=無，1分=輕度，2分=中度，3分=重度，4分=極重度)，最后將三者積分相加得到總積分，并依據(jù)銀屑病皮損面積和疾病嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI)評分，將各組小鼠積分取平均值后 繪制皮損積分趨勢線，觀察各組小鼠皮損的變化情況。

1.4.2組織病理學(xué)觀察 各組小鼠干預(yù)結(jié)束后處死，取背部裸露皮膚，在生物組織脫水機中將皮損組織經(jīng)乙醇脫水、透明劑透明和浸蠟，接著使浸透蠟的組織塊包裹在石蠟塊中，切片(厚度約4 μm)、烤片、脫蠟、Mayer氏蘇木素染液染色和水溶性伊紅染液染色,風(fēng)干后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

1.4.3皮損組織中IL-17、IL-22、TNF-α表達水平檢測 取正常組、模型組、紫草素高濃度組小鼠皮損組織，用預(yù)冷的PBS沖洗，去除殘留血液，稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與PBS按1∶9的比例混合，加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。最后將勻漿液于5 000 r/min離心5～10 min，取上清液，按照TNF-α、IL-17、IL-22的ELISA試劑盒說明操作檢測。

1.4.4皮損組織中RASSF1A、CXCL1、CXCL2、S100A7、YAP、TAZ mRNA表達水平檢測 取-80 ℃冰箱中保存的新鮮冰凍正常組、模型組、紫草素高濃度組小鼠皮損組織，使用 Trizol法提取總RNA。根據(jù)吸光光度值按下列公式計算樣品RNA的濃度：總RNA濃度(μg/μL)=OD 260×40×10-3。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒生成cDNA后，稀釋5倍在檢測系統(tǒng)上進行逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)，數(shù)據(jù)以2-△△Ct進行分析?；蛱禺愋砸镄蛄校篟ASSF1A上游5’-CCAGCAAGAAACCACCTTCC-3’，下游5’-CCGTTCAGTTCGCTCAAAGA-3’；CXCL1上游5’-CACCTCAAGAACATCCAGAGC-3’，下游5’-CTTGGGGACACCTTTTAGCA-3’；CXCL2上游5’-AGTGAACTGCGCTGTCAATG-3’，下游5’-CAGGGTCAAGGCAAACTTTTT-3’；S100A7上游5’-ACACTGCTTCCATCACTATGC-3’，下游5’- TTTTGTCAGCTGCCCGGAA-3’；YAP上游5’-ACCCTCGTTTTGCCATGAAC-3’，下游5’-TTCAACCGCAGTCTCTCCTT-3’；TAZ上游5’-CTGCGCTTCAAATGGGTAGGA-3’，下游5’-CAAAGCGGGGGAAGTAGGG-3’；GAPDH上游5’-ATGGGTGTGAACCACGAGA-3’，下游5’-CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3’。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠皮損及PASI評分比較 模型組小鼠造模第2天開始背部剃毛皮膚出現(xiàn)紅斑、鱗屑和厚度增加，之后持續(xù)進展；紫草素各組小鼠造模第2天開始背部剃毛皮膚出現(xiàn)發(fā)紅，附有鱗屑及肥厚的現(xiàn)象，但是與模型組相比程度明顯減輕，且紫草素濃度越高，皮損越輕。PASI評分顯示，模型組和紫草素各組均明顯高于正常組(P均<0.05)，紫草素高、中、低濃度組均明顯低于模型組(P均<0.05)，紫草素高濃度組明顯低于中、低濃度組(P均<0.05)。見圖1及圖2。

圖1 各組小鼠實驗第7天皮損表現(xiàn)

圖2 各組小鼠不同時間皮膚病變紅斑評分、鱗屑評分、厚度評分及總評分

2.2各組小鼠皮膚組織病理學(xué)表現(xiàn) HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠皮膚組織基底層為單層柱狀細胞；模型組小鼠皮損表皮向下延伸，角化不全，顆粒層減少或消失，棘層增厚，炎性浸潤；紫草素各組小鼠皮損表皮厚度減少，棘皮病減輕和輕微炎性細胞浸潤，且皮損減輕程度與紫草素濃度成正向相關(guān)。見圖3。

圖3 各組小鼠皮膚組織病理學(xué)HE染色表現(xiàn)

2.3各組小鼠皮損組織中IL-17、IL-22、TNF-α表達水平比較 模型組、紫草素高濃度組小鼠皮損組織中IL-17、IL-22、TNF-α表達水平均明顯高于正常組(P均<0.05),紫草素高濃度組小鼠皮損組織中IL-17、IL-22、TNF-α表達水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖4。

圖4 各組小鼠皮損組織中IL-17、IL-22、TNF-α水平

2.4各組小鼠皮損組織中RASSF1A、CXCL1、CX-CL2、S100A7、YAP、TAZ mRNA表達水平比較 紫草素組小鼠皮損組織中RASSF1A mRNA表達水平明顯低于正常組(P<0.05)，CXCL1、CXCL2、S100A7、YAP、TAZ mRNA表達水平均明顯高于正常組(P均<0.05)；紫草素對銀屑病小鼠模型皮損組織中趨化因子和轉(zhuǎn)錄因子有明顯干預(yù)作用。見圖5。

圖5 各組小鼠皮損組織中RASSF1A、CXCL1、CXCL2、S100A7、YAP、TAZ mRNA表達水平

3 討 論

銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的炎癥性皮膚病，發(fā)病機制尚不清楚，主要是免疫細胞活化產(chǎn)生大量的趨化因子和炎癥細胞因子，介導(dǎo)嗜中性粒細胞的募集，形成Munro微膿腫[6]。銀屑病皮膚炎癥的發(fā)生，是由于活化的RAS基因在皮膚基底上的過表達引起的[7-8]，RAS在基底角質(zhì)形成細胞(KC)中的過表達導(dǎo)致銀屑病皮膚發(fā)炎、棘皮增厚、角化過度，表皮內(nèi)中性粒細胞和T細胞包括IL-17、IFN-γ、CD8+T

細胞浸潤[8-10]。過表達RAS的KC可能通過釋放與CD8+T細胞上 特異性表達的CXCR6相互作用的CXCL16介導(dǎo)CD8+T細胞進入人類皮膚[11]，優(yōu)先在CD8+T細胞上表達，產(chǎn)生IFN-γ和IL-17，有利于中性粒細胞募集和Munro微膿腫形成[11-12]，增強KC活化和增殖[13]，促進中性粒細胞吸引CXCL1和S100家族成員(S100A7，S100A8和S100A9)的KC產(chǎn)生[13-14],并有助于CD4+T細胞活化，有利于CD4+T細胞滲入皮膚[8-9]，產(chǎn)生IL-17、IL-22、TNF-α、IL-23[1，9，14]。IL-17參與免疫反應(yīng)，可促進血管生成，加速表皮增殖，促進中性粒細胞浸潤與活化。IL-22可促角質(zhì)形成細胞生成，誘導(dǎo)細胞免疫紊亂，加重銀屑病。TNF-α主要由單核巨噬細胞產(chǎn)生，是一種促炎癥性細胞因子，可誘導(dǎo)趨化因子和黏附因子，活化中性粒細胞與血管內(nèi)皮細胞而引起機體強烈的炎癥反應(yīng)，在誘發(fā)銀屑病的炎癥增生過程及維持銀屑病炎性浸潤中起重要作用[15]。

Hippo-YAP途徑是一個由一系列蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子組成的激酶級聯(lián)反應(yīng)，是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)誘導(dǎo)的血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)[16]。Hippo-YAP/TAZ的失調(diào)，影響T細胞的增殖分化，導(dǎo)致自身免疫和/或炎癥性疾病[17]。成年基底表皮細胞核中YAP的過度表達可導(dǎo)致皮膚增厚[18]，而YAP和TAZ缺失導(dǎo)致傷口愈合能力減弱[6]。RASSF1A為RAS的效應(yīng)蛋白，其可與YAP結(jié)合。銀屑病細胞與鱗狀細胞癌(Cscc)細胞極為相似，YAP可能通過激活與Cscc細胞相關(guān)的AREG/RAS/AKT/ERK軸[19]，調(diào)節(jié)銀屑病角質(zhì)形成細胞的細胞增殖、細胞周期和凋亡。

既往研究證實，紫草素可通過JAK/STAT3途徑的激活誘導(dǎo)CEBP-δ蛋白表達下調(diào)，抑制角質(zhì)形成細胞的增殖[20]；可通過抑制AKT/mTOR途徑來有效促進iTreg細胞的分化減緩炎癥的發(fā)展[21]；還可抑制血管增生，通過阻滯JAK2/STAT3途徑抑制IL-17誘導(dǎo)的VEGF表達[22]。本實驗結(jié)果顯示，紫草素能夠改善咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病皮損，減少皮損厚度、紅斑及鱗屑；且紫草素干預(yù)后，小鼠皮損組織中IL-17、IL-22、TNF-α水平和CXCL2、S100A7、YAP、TAZ mRNA表達水平均明顯降低，RASSF1A、 CXCL1 mRNA表達水平均明顯升高。說明紫草素有抗炎作用，可通過調(diào)節(jié)Hippo-YAP信號通路中的趨化因子及轉(zhuǎn)錄因子干預(yù)銀屑病的進展。

本實驗結(jié)果顯示，紫草素通過增加皮膚基底RASSF1A mRNA的含量，降低Hippo-YAP信號通路上游轉(zhuǎn)錄因子YAP、TAZ的含量，致下游趨化因子和炎癥因子CXCL1、CXCL2、S100A7、IL-17、IL-22、TNF-α降低達到抗銀屑病的作用，改善IMQ誘導(dǎo)的銀屑病皮損病理表現(xiàn)，減少皮損厚度、紅斑及鱗屑。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。