李 慧，冷 靜，趙 磊

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院, 新疆 烏魯木齊 830000；2. 新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830000)

肺癌是目前世界上發(fā)病率和病死率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。研究表明，肺癌的發(fā)生與機(jī)體內(nèi)VEGF/VEGFR信號通路的異常表達(dá)有關(guān)[1-3]。小青龍湯出自中國古典醫(yī)學(xué)著作《傷寒論》，有解表散寒、溫肺化飲之功效，常用于治療肺部及呼吸道相關(guān)疾病?，F(xiàn)代研究表明小青龍湯對于肺癌的具有一定的治療作用，其能夠提高患者生活質(zhì)量,延長生存時間，并能夠抑制 H292細(xì)胞增殖及炎癥因子的釋放[4-5]，然而小青龍湯對肺癌的藥理作用機(jī)制尚不清楚，故本研究通過動物實驗進(jìn)行了探討，以期為肺癌的臨床治療提供新的參考和依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1藥物與儀器 小青龍湯購自建嘉制藥有限公司，貝伐珠單抗購自上海羅氏制藥有限公司；RNA提取試劑盒、RIPA蛋白裂解液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天公司，VEGF、VEGFR2及GAPDH抗體購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，雙垂直電泳儀、轉(zhuǎn)印電泳儀、凝膠成像儀購自伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司。

1.2動物 清潔級成年雄性SD大鼠30只，6～8周齡，體質(zhì)量(180±20)g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物合格證號：SYXK(新)2016-0002。動物房溫度(22±2)℃，濕度(50±10)%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。

1.3分組、造模及干預(yù)方法 選擇6只大鼠作為對照組，其余24只大鼠參照文獻(xiàn)[6-7]方法建立肺癌模型。具體方法：使用含10%胎牛血清的RMPI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)Walker-256癌細(xì)胞至對數(shù)增長期，收集Walker-256細(xì)胞，將Walker-256細(xì)胞調(diào)整為密度1×107個/mL的細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液按照0.2 mL/只接種到KM小鼠腹腔，1周內(nèi)出現(xiàn)腹水。使用無菌注射器抽取KM小鼠Walker-256細(xì)胞腹水，用生理鹽水稀釋后，調(diào)整細(xì)胞密度為0.5×105個/mL，按照0.2 mL/只經(jīng)SD大鼠尾靜脈注射腹水細(xì)胞懸液，繼續(xù)喂養(yǎng)3周后，使用高分辨率數(shù)字小動物X射線機(jī)對所有大鼠行胸部影像學(xué)檢查，觀察到肺部腫物形成視為造模成功。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、小青龍湯組、貝伐珠單抗組、小青龍湯聯(lián)合貝伐珠單抗組，每組6只，然后小青龍湯組給予小青龍湯10 mL/kg灌胃，貝伐珠單抗組給予貝伐珠單抗2 mg/kg腹腔注射，小青龍湯聯(lián)合貝伐珠單抗組給予小青龍湯10 mL/kg灌胃和貝伐珠單抗2 mg/kg腹腔注射，模型組及對照組灌胃等量生理鹽水，均1次/d，連續(xù)28 d，最后一次干預(yù)24 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4觀察指標(biāo)與方法

1.4.1p16、p21及p53 mRNA表達(dá)實時定量PCR檢測 頸椎脫臼處死大鼠后，迅速分離大鼠肺組織，取適量肺組織采用RNA提取試劑盒分別提取肺組織的總RNA。將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，實時定量PCR檢測肺組織中p16、p21及p53 mRNA表達(dá)情況。p16引物序列：正向引物5’- GGTCGGAGCCCGATTCA-3’， 反向引物5’-ACGGGGTCGGCACAGTT-3’； p21引物序列：正向引物5’- CAGTACTCTCCTCCCCTCA-3’， 反向引物5’- CCCATGCAGGAGCTATTAC-3’； p53引物序列：正向引物5’- GATGACTGCCATGGAGGAGT-3’， 反向引物5’- CTGTCCCAGACTTCAGGAAA-3’； β-actin引物序列：正向引物5’- ACCGCCGTACA-GAAGAAG-3’， 反向引物5’- CCCCACTTTCTTGACCATTG-3’。實時定量PCR結(jié)果采用2-△△Ct法計算相對表達(dá)量。

1.4.2肺組織細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞術(shù)檢測 取適量大鼠肺組織，剪碎，1% 胰酶消化30 min，反復(fù)吹打后，經(jīng)流式細(xì)胞儀分選純化細(xì)胞系，制成細(xì)胞懸液，然后加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，再加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫(20～25 ℃)孵育15 min，然后加入10 μL碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，室溫(20～25 ℃)避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中，用流式細(xì)胞儀檢測。

1.4.3肺組織病理觀察 大鼠斷頭處死后，迅速分離肺組織，用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈表面血液，用濾紙吸干表面水分后，放入10%中性甲醛中固定24 h后轉(zhuǎn)移至75%的乙醇中，經(jīng)自動組織脫水機(jī)脫水、透明處理，在石蠟包埋機(jī)中浸蠟、包埋，進(jìn)行5 μm切片，水浴展開，撈片，瀝干，放恒溫箱中烘干，置于烘箱中60 ℃烤2 h，常規(guī)蘇木精-伊紅染色(HE)染色，置于通風(fēng)櫥，待乙醇徹底干后依次置于二甲苯(I)5 min→二甲苯(Ⅱ)5 min，待載玻片上殘留二甲苯揮干后用中性樹膠封片，在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.4.4大鼠肺組織中VEGF、VEGFR2表達(dá)Western blot檢測 將大鼠肺組織放入玻璃勻漿器中，加入RIPA蛋白裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解，置于4 ℃離心機(jī)以12 000 r/min離心10 min，用移液槍將上清液移至另一干凈離心管中，并向其中加入SDS loading buffer，混勻后放入100 ℃水浴5 min，然后放入-20 ℃儲存?zhèn)溆?。將凍存的肺組織蛋白液于室溫下融化后，采用BCA法測定蛋白濃度，處理好待測樣品后，取50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)膜，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1 h，經(jīng)VEGF、VEGFR2及GAPDH抗體(1∶1 000)孵育后，4 ℃過夜。PBST充分洗膜后，加入二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h，PBST清洗后顯色液顯影，利用凝膠成像儀成像后，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行免疫印跡灰度值分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肺組織中p16、p21、p53 mRNA表達(dá)情況 模型組大鼠肺組織中p16、p21及p53 mRNA相對表達(dá)量均顯著高于對照組(P均<0.05)；小青龍湯組、貝伐珠單抗組及小青龍湯聯(lián)合貝伐珠單抗組大鼠肺組織中p16、p21及p53 mRNA相對表達(dá)量均顯著低于模型組，且貝伐珠單抗組及小青龍湯聯(lián)合貝伐珠單抗組均顯著低于小青龍湯組，小青龍湯聯(lián)合貝伐珠單抗組顯著低于貝伐珠單抗組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肺組織中p16、p21及p53 mRNA相對表達(dá)量比較

2.2各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率 對照組、模型

組、小青龍湯組、貝伐珠單抗組、小青龍湯聯(lián)合貝伐珠單抗組肺組織細(xì)胞凋亡率分別為(8.11±1.52)%，(2.74±1.48)%，(18.87±3.14)%，(29.89±2.91)%，(40.60±2.78)%。模型組細(xì)胞凋亡率顯著低于對照組(P<0.05)；小青龍湯組、貝伐珠單抗組及小青龍湯聯(lián)合貝伐珠單抗組細(xì)胞凋亡率均顯著高于模型組，且貝伐珠單抗組及小青龍湯聯(lián)合貝伐珠單抗組顯著高于小青龍湯組，小青龍湯聯(lián)合貝伐珠單抗組顯著高于貝伐珠單抗組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖

2.3各組大鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn) 模型組大鼠肺組織細(xì)胞排列不整齊，細(xì)胞間隙縮小，細(xì)胞核增大，染色加深；小青龍湯組、貝伐珠單抗組及小青龍湯聯(lián)合貝伐珠單抗組大鼠肺組織細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞核有所縮小，核仁明顯，染色較淺。見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織病理學(xué)HE染色表現(xiàn)(×400)

2.4各組大鼠肺組織中VEGF、VEGFR2表達(dá)水平模型組大鼠肺組織中VEGF、VEGFR2表達(dá)水平顯著高于對照組(P均<0.05)；小青龍湯組、貝伐珠單抗組及小青龍湯聯(lián)合貝伐珠單抗組大鼠肺組織中VEGF、VEGFR2表達(dá)水平均顯著低于模型組，且貝伐珠單抗組及小青龍湯聯(lián)合貝伐珠單抗組均顯著低于小青龍湯組，小青龍湯聯(lián)合貝伐珠單抗組顯著低于貝伐珠單抗組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠肺組織中VEGF、VEGFR2表達(dá)情況

3 討 論

肺癌發(fā)病與吸煙、年齡、性別、空氣污染、居住環(huán)境等因素密切相關(guān)[8-10]。目前，已經(jīng)明確肺癌的發(fā)病機(jī)制與機(jī)體VEGF/VEGFR信號通路相關(guān)蛋白的過度激活密切相關(guān)[1-3]。VEGF/VEGFR通路是由血管生成所需的蛋白家族構(gòu)成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其與機(jī)體生長發(fā)育、骨骼肌肥大、月經(jīng)、妊娠和傷口愈合等病理生理過程密切相關(guān)，同時VEGF/VEGFR通路的異常激活也會導(dǎo)致新生血管疾病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病等疾病的發(fā)生[11-12]。目前已經(jīng)上市多種抑制VEGF/VEGFR信號通路的藥物，其中貝伐珠單抗是目前臨床常用的VEGF/VEGFR信號通路抑制劑之一，故本研究選擇該藥進(jìn)行對照研究。

p16、p21及p53基因是一組腫瘤抑制基因，在正常細(xì)胞中，它們可以通過調(diào)控DNA修復(fù)等一系列生理過程造成細(xì)胞周期停滯，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并能夠長期維持基因組和細(xì)胞穩(wěn)定，抑制腫瘤細(xì)胞生長及腫瘤組織血管再生。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中p16、p21及p53基因發(fā)生突變，并存在過度表達(dá)現(xiàn)象，從而引起細(xì)胞周期紊亂，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞反饋性無限制增殖，促進(jìn)了腫瘤疾病的進(jìn)一步惡化[13-14]。因此，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中p16、p21及p53基因的表達(dá)能夠通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生命周期進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

小青龍湯傳統(tǒng)用來治療慢性阻塞性肺氣腫、支氣管哮喘、急性支氣管炎、肺炎等疾病，對肺組織及呼吸道具有明顯的保護(hù)作用。相關(guān)實驗研究發(fā)現(xiàn)，小青龍湯可明顯舒張哮喘大鼠的支氣管平滑肌，能夠抑制大鼠肺組織纖維化，降低肺源性心臟病大鼠的肺動脈高壓[15-16]。

本實驗研究了小青龍湯對肺癌大鼠的作用及機(jī)制，結(jié)果顯示小青龍湯組、貝伐珠單抗組及小青龍湯聯(lián)合貝伐珠單抗組大鼠肺組織中p16、p21、p53 mRNA表達(dá)量及VEGF、VEGFR表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，肺組織病理學(xué)得到顯著改善。提示小青龍湯能夠抑制大鼠肺癌組織抗凋亡基因的過度表達(dá)，顯著促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡，抑制大鼠肺組織進(jìn)一步惡化，其可能通過抑制VEGF/VEGFR信號通路的過度激活而發(fā)揮抗腫瘤作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。