范寧波, 周俊學, 江凱, 王宏, 史龍飛, 高玉龍, 陳頤

(1.河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院, 鄭州 450002; 2.河南省煙草公司洛陽市公司, 河南 洛陽 471000; 3.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院, 昆明 650031)

烤煙是一種廣泛種植的經(jīng)濟作物，在我國國民經(jīng)濟中占有重要地位[1]。在影響煙葉質(zhì)量的諸多因素當中，煙葉的成熟度占據(jù)著首要地位，好的成熟度才能夠保證烤后煙葉的良好品質(zhì)及可用性[2]。煙草的成熟過程也是衰老過程，目前關(guān)于植物衰老的各種學說有自由基衰老學說、內(nèi)源激素調(diào)節(jié)學說和細胞程序性死亡學說等，其中最被認可的為自由基衰老學說[3]，該學說認為植物衰老的過程即活性氧代謝失調(diào)、不斷積累的過程[4]?；钚匝跏巧矬w新陳代謝產(chǎn)生的一大類副產(chǎn)物，它的代謝失衡與膜質(zhì)過氧化是生物衰老的重要原因[5]。煙葉的成熟度不同，其活性氧的積累差異很大[6]，采收成熟度是影響煙葉可用性的重要指標[7-8]?；钚匝蹙哂袠O高的活性和毒性，會對一些生物大分子物質(zhì)(如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等)產(chǎn)生氧化破壞，使有毒物質(zhì)積累增加，甚至引起細胞死亡[9]。因此，對烤煙成熟過程中活性氧及膜脂過氧化產(chǎn)物積累進行研究，對煙葉的成熟采收具有重要意義。關(guān)于煙草葉片的活性氧研究已有不少，活性氧的積累也經(jīng)常被用作煙草抗逆能力的衡量指標[10-12]。植物的衰老是一個受多基因調(diào)控的積極調(diào)節(jié)過程。煙草中NtCP1和NtCP2是編碼半胱氨酸蛋白酶的基因，其中NtCP1是一個高度衰老特異表達基因，只在自然衰老的煙草中表達，具有很強的穩(wěn)定性，不容易被外界環(huán)境所影響；NtCP2在成熟的煙草葉片中表達，但在衰老葉片中表達下調(diào)，且容易被逆境脅迫所影響，二者是煙草中常見的與衰老有關(guān)的基因[13]。由于煙草的工業(yè)用途，關(guān)于煙葉的研究一般都集中在葉片中，而對于煙葉主脈的研究卻很少，關(guān)于煙葉在成熟和衰老過程主脈中活性氧等物質(zhì)的變化更是尚未見報道。葉脈對于植物葉片的水分運輸和生長至關(guān)重要[14-15]，并且煙草的葉片主脈可以有效影響煙葉的烘烤品質(zhì)，因而煙葉主脈對于煙草品質(zhì)的影響更加深遠[16-17]。本研究以烤煙品種‘K326’和‘豫煙6號’為試驗材料，研究采后煙葉主脈中的活性氧、膜脂過氧化產(chǎn)物積累以及相關(guān)衰老基因表達規(guī)律，旨在從主脈的角度來衡量煙葉的成熟狀況，從而為煙葉的成熟采收提供理論指導(dǎo)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018年在河南省洛陽市洛寧縣煙葉標準化生產(chǎn)示范田進行，選用當?shù)刂髟钥緹熎贩N‘K326’和‘豫煙6號’為試驗材料，試驗田土壤為黃棕壤，土壤基本理化性質(zhì)：pH 7.26，有機質(zhì)13.52 g·kg-1，堿解氮75.18 mg·kg-1，速效磷9.17 mg·kg-1，速效鉀164.37 mg·kg-1，每株留葉數(shù)均為18片，田間管理措施均按照當?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程進行[18]。

1.2 試驗設(shè)計

依據(jù)趙銘欽等[19]對于成熟度的劃分，將煙葉分別設(shè)定為欠熟、未熟、尚熟、適熟和過熟5個成熟度，分別選取長勢一致的煙株進行取樣，取樣部位為中部葉(10～12葉位)，將煙葉的主脈從葉片中剝離備用。一部分樣品在采集后立即放入干冰中速凍帶回實驗室，并轉(zhuǎn)移至-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫糜谙嚓P(guān)生理指標檢測和基因表達測定，其他樣品用于NBT化學組織染色。每個時期進行3次生物學重復(fù)。

1.3 測定指標及方法

1.3.1NBT組織化學染色 用吉列雙刃刀片于載玻片上取1 mm厚的煙葉主脈截面(靠近端口處)切片，將主脈切片投入盛有0.1% NBT的離心管中，染色48 h后取出主脈切片，吸干水分，在M165 FC立體式顯微鏡(LECIA, 德國)下拍照并分析染色情況[20]。

1.3.2O2-、H2O2和MDA含量的測定 分別使用超氧陰離子測試試劑盒(SA-2-G，蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)、過氧化氫測試試劑盒(H2O2-2-Y，蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)，并嚴格按照說明書測定O2-和H2O2含量，使用硫代巴比妥酸法[21]測定丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.3.3衰老相關(guān)基因表達的測定 以未熟的‘K326’煙葉主脈作為對照，使用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測基因的相對表達量。從GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中檢索煙草NtCP1、NtCP2序列并設(shè)計相關(guān)引物，以煙草核糖體蛋白基因L25為內(nèi)標基因。引物用Roche LCPDS2軟件設(shè)計，并由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。使用R1200-50T RNA抽提試劑盒(索萊寶)提取總RNA，利用NanoDrop 2000分光光度計(Thermo Scientific，USA)測定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，并將待測RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用QuantiFast?SYBR?Green PCR Kit試劑盒(Qiagen，Germany)在LightCycler?480 Ⅱ型熒光定量PCR儀(Roche，Swiss)上進行反應(yīng)。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，85 ℃反應(yīng)5 s，40個循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_量的計算采用 2-ΔΔCt法[22]。

表1 衰老相關(guān)基因引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2010 進行數(shù)據(jù)處理、分析及繪圖，采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同成熟度煙葉主脈的NBT染色結(jié)果

NBT組織化學染色結(jié)果(圖1)顯示，隨著煙葉成熟度的增加，其煙葉主脈的活性氧也會逐漸積累。在未熟煙葉中，主脈不產(chǎn)生藍色沉淀；當煙葉達到欠熟狀態(tài)時，主脈中略有藍色沉淀產(chǎn)生；當煙葉表現(xiàn)為尚熟和適熟階段時，主脈切片中產(chǎn)生的藍色沉淀明顯增多；而當煙葉過熟時，藍色沉淀幾乎覆蓋了整個主脈切片，表明活性氧在過熟葉片的主脈中大量積累，且‘K326’和‘豫煙6號’兩個品種烤煙主脈染色的變化趨勢一致，二者間基本沒有差異?？梢?，煙葉的成熟過程也是活性氧物質(zhì)積累的過程。

圖1 不同成熟度煙葉主脈的NBT染色

2.2 成熟過程煙葉主脈的活性氧物質(zhì)累積

由圖2可知，在煙葉成熟過程中，‘豫煙6號’主脈中的O2-含量一直高于‘K326’。在煙葉未熟時，‘K326’和‘豫煙6號’的O2-含量之間沒有顯著差異，隨著成熟度的增加，兩者之間的差別開始增大，在欠熟、尚熟和適熟時，兩個品種之間差異顯著。隨著成熟度的增加，兩個品種煙葉主脈中O2-的增加速率均表現(xiàn)出慢-快-慢-快的變化趨勢。H2O2和MDA含量的變化與O2-含量的變化趨勢基本一致，隨著煙葉成熟度的增加也均逐漸增加。相對于未熟時期，當煙葉達到過熟程度時，‘K326’中的O2-、H2O2和MDA含量分別增加了2.81、2.02、3.59倍；‘豫煙6號’的O2-、H2O2和MDA含量分別增加了2.40、1.85和3.67倍。

注:*表示兩個品種間差異在P<0.05或P<0.01水平具有顯著性。

2.3 成熟過程中煙葉主脈衰老相關(guān)基因的表達

為了從分子水平上探索煙草主脈的衰老機理，本研究對衰老相關(guān)基因的表達進行了檢測。結(jié)果如圖3所示，在煙葉的成熟過程中，‘K326’和‘豫煙6號’煙葉主脈的NtCP1基因表達均呈持續(xù)上升趨勢，且在煙葉過熟時期基因表達量最高。兩個品種的NtCP2基因的表達趨勢也一致，但NtCP2的表達趨勢與NtCP1有很大差異，成熟過程中，其表達量逐漸增加，在尚熟時達到最大值，然后其表達量又逐漸降低，直至在過熟時該基因的表達量低于未熟時期。在‘K326’和‘豫煙6號’兩個品種之間，僅在尚熟和適熟時期NtCP1的基因表達量存在顯著差異，其他時期兩個基因的表達在品種間均沒有顯著差異。

2.4 煙葉成熟過程中活性氧與衰老相關(guān)基因表達的相關(guān)性

對烤煙主脈中活性氧含量和衰老相關(guān)基因表達量進行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)在‘K326’的主脈中，MDA、H2O2和O2-三者存在極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。MDA、H2O2、O2-與NtCP1之間均存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，與NtCP2呈負相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)性并不顯著?！?號’主脈中相關(guān)指標之間的相關(guān)規(guī)律與‘K326’一致，這說明NtCP1基因與煙草衰老的關(guān)系更為緊密。

表2 活性氧、MDA含量及衰老相關(guān)基因的相關(guān)分析

3 討論

NBT染色法可以直觀、簡便、快捷地檢測葉片中活性氧的產(chǎn)生情況，是在生命科學研究中經(jīng)常采用的檢測方法[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著成熟度的增加，不同成熟度主脈的NBT染色斑的面積逐步增大，表明煙葉的成熟和衰老會導(dǎo)致其主脈中活性氧物質(zhì)的積累。O2-、H2O2是主要的活性氧自由基，可以破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)及功能，使細胞膜透性增加[23]，而MDA是膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物，其積累會對細胞造成一定的傷害[24]，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著煙葉成熟度的增加，主脈細胞中活性氧物質(zhì)(H2O2、O2-)逐漸積累，MDA含量增加，表明伴隨著煙葉的生長發(fā)育，主脈也隨之衰老，主脈細胞的膜脂過氧化程度逐漸增加，細胞膜由完整變得破裂，造成細胞衰老、死亡。

煙草中NtCP1和NtCP2皆為高度衰老特異表達基因，在細胞的程序性死亡中扮演著非常重要的角色[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，葉脈中NtCP1表達量在煙草成熟過程中呈逐漸上升的趨勢，基因表達規(guī)律與Beyene等[25]的研究結(jié)果一致，且與活性氧物質(zhì)和MDA含量的變化趨勢相吻合，這表明NtCP1基因在煙草細胞的程序性死亡過程中扮演著非常重要的角色；NtCP2的表達則呈先增加后降低的變化趨勢，與活性氧物質(zhì)和MDA含量之間存在負相關(guān)關(guān)系但相關(guān)性并不顯著。這可能與NtCP2在成熟的煙草葉片中表達較為明顯，但在衰老葉片中表達量反而下降，即基因的表達規(guī)律與煙葉的成熟規(guī)律并不一致，且與NtCP2的表達容易受到外界環(huán)境影響有關(guān)[13，18]。

在煙葉的成熟過程中，‘K326’和‘豫煙6號’主脈中的活性氧物質(zhì)、MDA含量及基因表達趨勢基本一致，并且整體上 ‘豫煙6號’主脈中的活性氧物質(zhì)、MDA含量及基因表達量均高于‘K326’，這可能與烤煙品種自身遺傳因素有關(guān)。綜上所述，本研究以煙葉的主脈為研究對象，發(fā)現(xiàn)伴隨著煙葉的成熟與衰老，煙草主脈中也會逐漸積累活性氧物質(zhì)和MDA，某些衰老相關(guān)基因的表達也會發(fā)生變化。該研究結(jié)果為實際生產(chǎn)中利用主脈來進行煙葉成熟度的判定提供了更多的理論支持，為煙葉的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供了指導(dǎo)。