(廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004)

青錢柳是中國特有的天然保健食品資源，含有豐富的天然藥用成分[1]，其中青錢柳多糖是近來研究的焦點，研究表明青錢柳中含有的植物多糖能夠促進血糖代謝、激活胰島器官等功能，在降血糖方面有獨特的功效，飲用青錢柳炮制的茶葉可以有效地緩解糖尿病[2]，且青錢柳多糖還具有顯著的抗氧化活性[3]。有色米作為天然的藥食兩用功能性食品[4]，其營養(yǎng)成分遠高于普通精白米。紅米中含有的生物活性物質(zhì)γ-氨基丁酸（GABA）和黃酮具有多種生物學(xué)功效[5]，如抗氧化、改善睡眠、降血壓、抗焦慮等[6]。以有色米為原材料，經(jīng)發(fā)酵或與其他食用、藥用植物混合發(fā)酵，可以獲得具有特定功效的保健酒[7]。

本實驗以紅米為原料，添加青錢柳浸提液混合固態(tài)發(fā)酵，獲得集青錢柳降血糖功效和紅米酒抗氧化功效于一體的低酒度保健型米酒。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：巴拉吉紅米和野生青錢柳葉以及青錢茶葉均由貴州雷山縣瑞康生態(tài)農(nóng)業(yè)投資有限公司提供。

酒曲：廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實驗室自主研發(fā)。

儀器設(shè)備：分析天平，PL303 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；雷磁pH 計，PSH-3C 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；生化培養(yǎng)箱，LRH-250A上海精宏實驗設(shè)備有限公司；日立氨基酸分析儀，L-8900 上海荊和分析儀器有限公司；恒溫水浴鍋，TW-12 重慶雅馬拓科技有限公司；島津分光光度計μ v1800，日本株式會社島津制作所。

1.2 試驗方法

1.2.1 青錢柳紅米酒釀造工藝及操作要點

本試驗所采用工藝如下：

1.2.1.1 青錢柳浸提液制備

青錢柳葉和水比例為1∶125，100 ℃下浸泡20 min，過濾，取濾液備用。

1.2.1.2 蒸煮

稱取500 g 紅米，加入上述浸提液1000 mL，浸泡12 h 后蒸煮40 min，要求米粒完整、熟而不糊、透而不爛、疏松均勻、外硬內(nèi)軟。

1.2.1.3 攤晾

將煮好的米攤晾，過程中適時攪拌，待其溫度降至30 ℃左右。在操作中應(yīng)注意周圍環(huán)境的衛(wèi)生，以減少被雜菌感染的機會。

1.2.1.4 拌曲

稱取酒曲，均勻撒于紅米表面上，攪拌，使米粒和酒曲完全混勻。

1.2.1.5 落缸壓實

將拌好的紅米飯放置在發(fā)酵容器中，用手壓實不留縫隙，然后用保鮮膜封口，并用橡皮筋包扎，放于保溫箱發(fā)酵。

1.2.2 單因素試驗

以酒精度、總酸、總糖、感官評分為指標，分別考察酒曲添加量A（0.6 %、1.4 %、1.8 %、2.0 %、2.4 %）、發(fā)酵溫度B（26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）和發(fā)酵時間C（5 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d）對青錢柳紅米保健酒品質(zhì)的影響。

1.2.3 正交試驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以酒曲添加量(A)、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）作為正交試驗的影響因素，每因素選擇3 水平，以青錢柳紅米酒的感官評分、酒精度為評價指標，采用L9(34)正交設(shè)計確定青錢柳紅米酒的最佳工藝參數(shù)，正交試驗因素與水平表如1所示。

表1 青錢柳紅米酒正交試驗的因素水平表

1.3 評價標準

1.3.1 酒精度

取發(fā)酵液100 mL，倒入500 mL蒸餾燒瓶中，補加蒸餾水100 mL，蒸餾并收集餾出液100 mL，用精密酒精計讀取酒精體積分數(shù)示值，按照GB/T 15038中附錄B 加以溫度校正，求得在20 ℃時酒精含量的體積分數(shù)，即為酒精度[8]。

1.3.2 感官評分標準

青錢柳紅米酒感官評分標準見表2。

1.3.3 黃酮含量的測定

用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯色法[9]，以蘆丁為標準品，準確配制0.12 mg/mL 的蘆丁標準溶液，分別吸取此標準溶液0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL 于6 只10 mL 具塞試管中，各加60 %vol 的乙醇到5 mL，然后加5 %的NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min后加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL，放置6 min后加入5%的NaOH溶液4 mL，最后加蒸餾水至刻度，搖勻，放置15 min，在500 nm波長下測定吸光值。以吸光值為縱坐標，蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程：y=5.1925x-0.0086，R=0.9989。

將樣品稀釋相當?shù)谋稊?shù)，配成樣品液，準確吸取樣品溶液1 mL，置于10 mL 具塞試管中，按上述方法測定吸光值，代入回歸方程計算樣品中黃酮含量，進行3次平行實驗。

表2 青錢柳紅米酒感官評價標準

1.3.4 青錢柳多糖的測定

用苯酚-硫酸法[10-11]，以葡萄糖為標準品，準確配制1.0 mg/mL 的葡萄糖標準溶液，分別吸取此標準溶液0.0 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL于100 mL 容量瓶中，加水定容，各吸取2 mL，置于10 mL 試管中，加入5%的苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5 mL，搖勻，于沸水浴中加熱20 min，迅速冷卻至室溫，在488 nm 波長下測定吸光值。以吸光值為縱坐標，葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程：y=6.2453x-0.6415(R2=0.9941)。

將樣品稀釋一定倍數(shù)，配成樣品液，準確吸取樣品溶液1 mL，置于10 mL 具塞試管中，按上述方法測定吸光值，代入回歸方程計算樣品中青錢柳多糖含量，進行3次平行實驗。

1.3.5 總酚含量的測定

用Folin-Ciocalteμ 法[12]，以沒食子酸為標準品，準確配制0.5 mg/mL 的沒食子酸標準溶液，分別吸取0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL沒食子酸標準溶液至25 mL 容量瓶中，用乙醇溶液定容至刻度。分別精確吸取上述不同濃度的溶液5.0 mL 至100 mL 容量瓶中，再分別加入蒸餾水50 mL，斐林試劑4 mL搖勻，靜置8 min。加入Na2CO3溶液8 mL，用蒸餾水定容至100 mL。在25 ℃搖床內(nèi)恒溫振蕩2 h，顯色后，以40%vol乙醇為空白，在765 nm波長下測定吸光值，以吸光值為縱坐標，沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程：y=10.641x+0.0395(R2=0.9996)。

將樣品稀釋一定倍數(shù)，配成樣品液，準確吸取樣品溶液1 mL，置于10 mL 具塞試管中，按上述方法測定吸光值，代入回歸方程計算樣品中總酚含量，進行3次平行實驗。

1.4 功能性成分測定

按優(yōu)化后的最佳工藝組合條件釀酒，測定黃酮、青錢柳多糖和總酚含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酒曲添加量對青錢柳紅米酒品質(zhì)的影響

酒曲添加量分別為0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%，30 ℃下恒溫箱發(fā)酵10 d。結(jié)果如圖1所示。

圖1 酒曲添加量對酒品的影響

由圖1 可知，在一定范圍內(nèi)，酒精度隨著酒曲添加量的增加顯著增加，但當酒曲添加量增加到一定程度時，酒精度的增加幅度很??；感官評分隨酒曲添加量的增加先增加后降低，在酒曲添加量為1%時，感官評分最高，此時的酒精度為16.7%vol。

2.1.2 發(fā)酵溫度對青錢柳紅米酒品質(zhì)的影響

酒曲添加量為0.8 %，分別在26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃恒溫箱中發(fā)酵10 d。

圖2 發(fā)酵溫度對酒品的影響

由圖2 可知，酒精度隨著溫度的上升先高后降低，這是因為低溫時酒曲中產(chǎn)淀粉酶的霉菌和酵母的活性比較低，產(chǎn)生的酒精少，隨著溫度的升高，霉菌和酵母的活性有所增強，產(chǎn)酒精能力也增強，溫度為30 ℃時酒精含量最高，為16.5 %vol，溫度超過30 ℃時，隨著溫度的升高，霉菌和酵母菌的活性又逐漸降低，產(chǎn)生的酒精變少；感官評分隨著溫度的升高先增加后降低，30 ℃時的感官評分最高。

2.1.3 發(fā)酵時間對青錢柳紅米酒的影響

酒曲添加量為0.8%，30 ℃恒溫箱中分別發(fā)酵4 d、6 d、8 d、10 d、12 d。

圖3 發(fā)酵時間對酒品的影響

由圖3 可知，酒精度隨著發(fā)酵時間的延長逐漸上升，最后趨于平緩；感官評分隨著發(fā)酵時間的延長先增加后降低，第10 天時的感官評分最高，此時的米酒酒度適中，口感平衡，第10 天后酒的感官評分有所下降，帶有苦味。

2.2 正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇酒曲添加量、溫度、發(fā)酵時間3 個因素進行正交試驗，對青錢柳紅米酒的工藝進一步優(yōu)化，結(jié)果如表3所示。

表3 青錢柳紅米酒正交試驗結(jié)果

由表3 可知，青錢柳紅米酒的最佳工藝組合為A2B2C3，即酒曲添加量為0.8%，發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時間為12 d。同時由極差R 可知，對青錢柳紅米酒品質(zhì)的影響順序為：發(fā)酵溫度＞酒曲添加量＞發(fā)酵時間。

2.3 功能性成分測定

按以上最佳工藝組合釀造青錢柳紅米酒，得到的米酒酒精度為16.9%vol，酒體清澈透亮，醇香濃郁，口感平衡，感官評分為90 分。測定酒的主要功能性成分，其黃酮含量為196.4 μg/mL，青錢柳多糖含量為203 μg/mL、總酚含量為108 μg/mL。

3 結(jié)論

本實驗通過單因素研究了溫度、酒曲添加量和發(fā)酵時間對青錢柳紅米酒質(zhì)量的影響，并通過正交試驗確定了最佳工藝組合，即酒曲添加量0.8%，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間為12 d。按照最佳工藝組合釀酒后，測定了青錢柳多糖、黃酮和總酚的含量，結(jié)果其含量均屬于較高水平，表明獲得的青錢柳紅米酒有較好的感官質(zhì)量和保健功效。

利用青錢柳復(fù)合紅米發(fā)酵保健酒，目前研究依然處于基礎(chǔ)研究，還沒有對其保健機制和功能進行研究。因此，需要對青錢柳復(fù)合紅米釀造的保健酒的保健機理和功能進一步研究，開發(fā)出一款新型的、具有保健功能的低酒精度飲品。