(寧夏紅枸杞產(chǎn)業(yè)有限公司，寧夏中寧 755100）

枸杞是藥食同源的植物，是中草藥的重要成分。具有較高的營養(yǎng)價值和生理保健功能，枸杞活性成分的研究是目前的熱點之一[1]。枸杞多糖作為天然植物多糖，無論在臨床應(yīng)用還是保健類食品的開發(fā)方面都具有廣闊的市場前景[2]。

隨著經(jīng)濟、現(xiàn)代醫(yī)學和食品科學的發(fā)展，人們越來越重視食品的營養(yǎng)保健作用，枸杞飲料作為一種功能性保健飲品越來越深受人們的喜愛[3-4]，并且隨著發(fā)酵飲料行業(yè)的發(fā)展，將枸杞進行乳酸菌發(fā)酵，制成各類乳酸菌發(fā)酵飲料已經(jīng)成為了一種全球性飲品，它的功能越來越被人們認識，產(chǎn)品也越來越被消費者接受[5]。

本試驗首先對乳酸菌發(fā)酵枸杞時菌種接入量、混合菌種比例、發(fā)酵溫度進行優(yōu)化，選取風味最好、枸杞多糖保存率含量較高的原漿發(fā)酵工藝，再將發(fā)酵原漿進行調(diào)配，制成酸甜爽口，營養(yǎng)物質(zhì)豐富的枸杞飲料，為枸杞飲料產(chǎn)品開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

材料：寧夏中寧枸杞，寧夏紅枸杞產(chǎn)業(yè)有限公司提供；嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌，丹尼斯克公司提供。

試劑及耗材：白砂糖、檸檬酸、木聚糖酶、L-阿拉伯糖、穩(wěn)定劑，均為市售食品級，乙醇、亞硫酸鈉均為分析純。

儀器設(shè)備：TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海精密儀器廠；FA1004 精密電子天平，上海天平儀器廠；FW100 型萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵枸杞原漿工藝流程（圖1）

圖1 發(fā)酵枸杞原漿工藝流程

1.2.2 發(fā)酵條件試驗測試指標與方法

乳酸菌接種量的確定：以發(fā)酵液pH4.01 時，作為枸杞發(fā)酵原漿的發(fā)酵終點，發(fā)酵溫度為40 ℃，測定不同接種量4%、5%、6%、7%、8%條件下枸杞發(fā)酵原漿多糖保存率并進行風味評估。

發(fā)酵溫度的確定：以發(fā)酵液pH4.01 時，作為枸杞發(fā)酵原漿的發(fā)酵終點，乳酸菌接種量為6 %，測定不同發(fā)酵溫度38 ℃、40 ℃、42 ℃、44 ℃、46 ℃條件下枸杞發(fā)酵原漿多糖保存率并進行風味評估。

嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌混合比例的確定：以發(fā)酵液pH4.01 時，作為枸杞發(fā)酵原漿的發(fā)酵終點，乳酸菌接種量為6 %，發(fā)酵溫度為42 ℃，測定嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌混合菌種不同比例1∶1、1∶2、1∶3，2∶1、3∶1 條件下枸杞發(fā)酵原漿多糖保存率并進行風味評估。

1.2.3 枸杞多糖及多糖保存率的測定

枸杞多糖的測定：取1 mL 樣品加入到85%vol濃度的乙醇中沉淀2 h，8000 r/min離心5 min，棄上清留沉淀，用5 mL丙酮洗滌沉淀兩次后，以8000 r/min離心5 min，棄上清留沉淀。用5 mL 乙醚洗滌沉淀，4000 r/min 離心10 min，棄上清液留沉淀，等沉淀揮發(fā)至干后溶解于10 mL 蒸餾水中待測。按參照文獻[6]所述方法對枸杞多糖進行測定。

1.2.4 發(fā)酵枸杞飲料的制備工藝（圖2）

1.2.5 發(fā)酵枸杞飲料單因素試驗

圖2 發(fā)酵枸杞飲料的制備工藝

發(fā)酵枸杞原漿添加量對發(fā)酵枸杞飲料口感的影響：取9%的白砂糖，0.3%阿拉伯糖，加RO 水至200 mL，用檸檬酸調(diào)pH3.7，測定5 %、7 %、9 %、11 %、13 %發(fā)酵枸杞原漿添加量對飲料口感的影響。

白砂糖的添加量對發(fā)酵枸杞飲料口感的影響：取9 %發(fā)酵枸杞原漿，0.3 %阿拉伯糖，加RO 水至200 mL，用檸檬酸調(diào)pH3.7，測定5 %、7 %、9 %、11%、13%白砂糖添加量對飲料口感的影響。

檸檬酸的添加量對發(fā)酵枸杞飲料口感的影響：取9 %發(fā)酵枸杞原漿，0.3 %阿拉伯糖，9 %的白砂糖，加RO 水至200 mL，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH 值，測定pH值為3.3、3.5、3.7、3.9、4.1時飲料的口感。

根據(jù)以上單因素試驗的優(yōu)化結(jié)果，選取發(fā)酵枸杞原漿添加量（A）、白砂糖添加量（B），檸檬酸添加量（C）為影響因素，配制后飲料口感為響應(yīng)值，每個因素取3 個水平，軸向點設(shè)為±1，進行Box-Behnken 試驗設(shè)計。每個試驗重復3 次，取其平均值，各試驗因素水平見表1。

表1 試驗因素水平

1.2.6 發(fā)酵枸杞飲料感官評定

以發(fā)酵枸杞飲料的滋味、口感、氣味、色澤為評價指標，開展人工感官評定。分別邀請10 名男性和10 名女性人員，年齡階段隨機，身體健康，感官靈敏，并通過培訓，評定前30 min 要潔口，飲食清淡，不抽煙，品嘗每個樣品前需使用純凈水漱口，最后得分取20 名評定人員的平均分數(shù)。感官評定標準見表2。

表2 發(fā)酵枸杞飲料感官評分表

1.2.7 發(fā)酵枸杞飲料成分測定

飲料中蛋白質(zhì)的測定，參考國家標準GB 5009.5；飲料中脂肪的測定，參考國家標準GB 5009.6；飲料中碳水化合物的測定，按參考文獻[7]中對飲料碳水化合物的測定；飲料中枸杞多糖的測定，參考材料與方法1.2.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌接種量的確定(圖3)

由圖3 可以看出，多糖的保存率隨著乳酸菌接種量的逐漸增加而減小，這是因為乳酸菌將多糖類物質(zhì)分解成乳酸，導致多糖含量降低。在乳酸菌接種量在4 %～7 %之間，多糖的保存率的下降趨勢較為平緩，同時也可看出枸杞發(fā)酵原漿在乳酸菌接種量為6%時，其風味值達到了最高。為了保證風味值好，多糖保存率較高，最終選定乳酸菌的接種量為6%。

圖3 乳酸菌接種量對枸杞多糖保存率和原漿風味的影響

2.2 發(fā)酵溫度的確定(圖4)

圖4 發(fā)酵溫度對枸杞多糖保存率和原漿風味的影響

由圖4 可以看出，發(fā)酵溫度對多糖保存率的影響并不是很顯著，發(fā)酵溫度在44 ℃時，多糖保存率達到最低，這可能是因為在溫度為44 ℃時，混合菌的發(fā)酵效率最高，對多糖的分解也達到最高[8]。從圖4 還可看出，在發(fā)酵溫度為44 ℃時，枸杞發(fā)酵原漿擁有良好的風味，與42 ℃發(fā)酵條件下相比，其風味相差并不大。鑒于42 ℃下枸杞發(fā)酵原漿擁有較高的枸杞多糖保存率以及良好的感官評分，因此，選定發(fā)酵溫度為42 ℃。

2.3 嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌混合比例的確定(圖5)

由圖5 可看出，枸杞多糖保存率在嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌混合比例1∶3 條件下最低，2∶1條件下最高，其他混合比例下多糖保存率都具有一定的差異性，造成這種現(xiàn)象的原因可能是不同乳酸菌對多糖的分解能力不同。在兩種菌混合比例為2∶1時，其風味值也同時達到了最高，因此最終確定嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌混合比例為2∶1。

圖5 嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌混合比例對枸杞多糖保存率和原漿風味的影響

2.4 發(fā)酵枸杞飲料單因素試驗結(jié)果(圖6、圖7)

圖6 枸杞發(fā)酵原漿、白砂糖添加量對枸杞飲料口味影響

圖7 檸檬酸添加量對枸杞飲料口味影響

由圖6、圖7 可以看出，不同調(diào)配方式，其飲料的感官風味各不相同。選取各因素下飲料風味值最高的條件，初步確定發(fā)酵枸杞飲料的配制方案為：發(fā)酵枸杞原漿添加量大致為7 %，白砂糖添加量大致為9%，飲料pH值3.7。

2.5 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果分析

按照表1 用Box-Behnken 軟件(V8.0.6) 設(shè)計的3因素3水平實驗方案（表3）。

用Design-Expert 軟件對表中數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到發(fā)酵枸杞飲料感官評定（Y）相對于發(fā)酵枸杞原漿添加量（A）、白砂糖添加量（B），檸檬酸添加量（C）的多項回歸方程為：

表3 響應(yīng)面實驗方案及結(jié)果

由表4的分析結(jié)果可以知，在一次項中，A對枸杞發(fā)酵飲料口感的影響極顯著（P＜0.01）；B對枸杞發(fā)酵飲料口感的影響顯著（P＜0.05）；C對枸杞發(fā)酵飲料口感的影響為極顯著（P＜0.01）；AB、AC、BC這3對交互作用的分析中均為極顯著（P＜0.01），由此可知，各個因素與響應(yīng)值不僅是單純的線性關(guān)系。在該實驗設(shè)計范圍內(nèi)，R2＝0.9920，實驗誤差較小，模型為極顯著（P＜0.0001），說明模型與實際實驗擬合良好。

回歸方程一次項回歸系數(shù)絕對值大小依次為枸杞發(fā)酵原漿（A）、檸檬酸添加量（B）、白砂糖添加量（C）。整體模型的回歸系數(shù)R2＝0.9641，說明模型響應(yīng)發(fā)酵枸杞飲料感官評分變化95.36%來自所選因素變量。

2.6 兩因素之間的交互作用

由以上得出的模型可以做出響應(yīng)面圖和等高線圖(圖8—圖10)，各因素及其交互作用對響應(yīng)值的影響可以通過組圖直觀表現(xiàn)出來。等高線圖反映了交互作用的強弱[9-10]，通過分析等高線圖可以得出每兩個因素中對飲料口感影響較大的因素。

表4 枸杞發(fā)酵飲料感官評定回歸模擬方差分析

圖8 發(fā)酵枸杞原漿添加量、白砂糖添加量響應(yīng)面及等高線

圖9 發(fā)酵枸杞原漿添加量、檸檬酸添加量響應(yīng)面及等高線

圖10 檸檬酸添加量、白砂糖添加量響應(yīng)面及等高線

從圖8 可以看出，發(fā)酵枸杞原漿、白砂糖添加量的過高和過低都不利于發(fā)酵枸杞飲料口感的提升；發(fā)酵枸杞原漿添加量和白砂糖添加量等高線趨近橢圓，說明兩者之間交互作用明顯。從圖9 可以看出，過高和過低的發(fā)酵枸杞原漿、檸檬酸添加量同樣不利于發(fā)酵枸杞飲料口感的提升；發(fā)酵枸杞原漿添加量和檸檬酸添加量等高線趨近橢圓，說明兩者之間交互作用明顯；從圖10 可以看出，白砂糖添加量對整體口感的影響并沒有檸檬酸添加量所造成的影響大；兩者的等高線趨近橢圓，說明兩者之間同樣有交互作用。

2.7 驗證性實驗

根據(jù)設(shè)計所得模型分析可得，枸杞發(fā)酵飲料調(diào)配方案為：發(fā)酵枸杞原漿添加量6.86 %，白砂糖添加量9.09 %，檸檬酸調(diào)節(jié)飲料pH3.65，發(fā)酵枸杞飲料感官評分可達到95.78 分。為驗證響應(yīng)面結(jié)果所得可靠性，根據(jù)實際操作，將發(fā)酵枸杞原漿添加量修正為6.8 %，白砂糖添加量9.1 %，檸檬酸調(diào)節(jié)飲料pH3.7；實際所得枸杞發(fā)酵飲料感官評分為95分，與模型相差0.81 %，說明模型與實際實驗擬合良好。

3 結(jié)論

通過單因素試驗，探討了含有較高枸杞多糖保存率和風味適宜枸杞原漿發(fā)酵的工藝。研究表明，當乳酸菌的接種量為6%，嗜酸乳桿菌和保加利亞乳桿菌混合比例為2∶1，發(fā)酵溫度為42 ℃，所發(fā)酵出的枸杞原漿多糖保存率較高且風味適宜。

通過響應(yīng)面試驗，探討了發(fā)酵枸杞飲料的調(diào)配工藝。研究表明，發(fā)酵枸杞原漿添加量為6.8%，白砂糖添加量9.1 %，檸檬酸調(diào)節(jié)飲料pH3.7，所調(diào)配出的發(fā)酵枸杞飲料色澤均勻，帶有純正枸杞發(fā)酵香味，口感順滑，是一款具枸杞發(fā)酵風味的獨特飲料。