馬玲，鄭小挺，楊麗娟，李琳，梅金鳳，范荷花（南昌市生殖醫(yī)院，江西 南昌 330004）

反復(fù)著床失敗(RIF)至今沒有明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)，一般認(rèn)為：移植3次及3次以上或移植10個以上胚胎或4個以上的優(yōu)質(zhì)胚胎均未能妊娠者，約占ART的10%，是IVF-ET中比較常見的問題，也是阻礙妊娠率提高的瓶頸問題［1］。如何改善這類患者的治療結(jié)局，提高著床成功率一直是生殖專家和胚胎學(xué)家探討的熱點問題。環(huán)孢素A（CsA）是一種廣泛應(yīng)用于臨床器官移植或自身免疫性疾病的免疫抑制劑。研究顯示，CsA具有改善滋養(yǎng)層細(xì)胞生物學(xué)行為和誘導(dǎo)免疫耐受，從而改善妊娠結(jié)局［2］。因此，研究CsA在反復(fù)著床失敗中的作用有助于為改善胚胎著床率提供新的治療方法。環(huán)孢素A（CsA）是一種早在1978年就在臨床器官移植后的免疫抑制劑，它使臨床上器官移植取得劃時代的進(jìn)展，同時在治療部分自身免疫性疾病方面也有一定的成效。CsA促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)功能且誘導(dǎo)母胎免疫耐受，同時CsA損傷DC細(xì)胞在中樞的遷移和成熟，誘導(dǎo)免疫耐受［3］。越來越多的證據(jù)表明，CsA不僅對免疫活性細(xì)胞有抑制作用，對多種類型細(xì)胞生物學(xué)功能具有調(diào)節(jié)作用（腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞等）。因此本研究是基于環(huán)孢素對妊娠免疫與滋養(yǎng)細(xì)胞的雙層調(diào)節(jié)作用這兩點基礎(chǔ)上進(jìn)行的研究探索?；谝陨瞎ぷ骰A(chǔ)，我們初步確定了CsA用于臨床IVF-ET治療RIF對胚胎的安全性，并預(yù)測其具有臨床治療的有效性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月1～2021年7月在我院生殖醫(yī)學(xué)科行IVF-ET的患者196例。隨機(jī)分為試驗組（服用環(huán)孢素A）102例和對照組（未服用環(huán)孢素A）94例。環(huán)孢素試驗組中100例完成研究，2例取消移植（2例均因無可移植胚胎故取消）。對照組中91例完成研究，3例取消移植（1例因內(nèi)膜＜7mm原因取消移植，2例因無可移植胚胎取消）。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表

1。方案經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

表1 兩組一般資料比較（±s）

表1 兩組一般資料比較（±s）

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1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）自愿參加本研究，同意按治療方案用藥及隨訪，并簽署CsA使用知情同意書；（2）健康狀況良好，臨床體檢和試驗室檢查無明顯異常（D-二聚體，凝血四項，優(yōu)生五項，抗核抗體，流產(chǎn)組套，狼瘡因子，甲亢五項等）；（3）年齡在20~35歲的婦女；（4）移植3次及3次以上失敗（或移植10個以上胚胎或4個以上的優(yōu)質(zhì)胚胎）；（5）內(nèi)分泌指標(biāo)基本正常；（6）磷脂抗體陰性；（7）TORCHIgM（-）；（8）夫婦雙方染色體核型正常；（9）宮腔鏡檢查無異常；（10）男方無嚴(yán)重的少、弱精子癥者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）夫妻雙方任何一方患有嚴(yán)重的精神疾患、泌尿系統(tǒng)急性感染、神經(jīng)系統(tǒng)或心血管系統(tǒng)的較重疾病或其它性傳播疾??；（2）女方有吸毒等嚴(yán)重不良嗜好；（3）任何一方接觸致畸量的射線、毒物、藥品并處于作用期；（4）曾患有或現(xiàn)患有CsA禁忌癥（嚴(yán)重感染、腫瘤、免疫缺陷癥、凝血功能障礙等）（5）對象要求終止治療或研究人員決定終止治療；（6）未按研究方案服藥或隨訪，影響結(jié)果分析判斷者。

1.3 方法 （1）試驗組：胚胎移植后，按IVF-ET常規(guī)方案維持黃體，即取卵日開始維持黃體16天，肌注，每天60mg，同時口服CsA 100～150mg/d。＜50kg用藥量為100mg/d；50～60kg用藥量125mg/d；＞60kg用藥量為150mg/d。使用CsA時機(jī)：鮮胚移植者在取卵后3日開始用CsA。F-ET者，人工替代周期者在使用黃體酮3日用CsA，自然周期者在排卵后3日用CsA。停藥時間：移植后13日抽血查人絨毛膜促性腺激素（β-hcg）檢驗妊娠，未妊娠者停藥。生化妊娠者繼續(xù)用藥至移植后1個月，直至B超證實宮內(nèi)見孕囊，并觀察到原始心血管搏動者，繼續(xù)用藥到移植后45天停藥。診斷宮外孕或流產(chǎn)者停藥。（2）對照組胚胎移植后，同試驗組同樣按IVF-ET常規(guī)方案維持黃體。

1.4 IVF-ET方案 自然周期用于平素月經(jīng)周期規(guī)律，無排卵障礙，子宮內(nèi)膜厚度無異常的患者。人工替代周期主要用于月經(jīng)周期不規(guī)律，不規(guī)律排卵或子宮內(nèi)膜有異常的患者。人工替代周期者一般于月經(jīng)第五天開始服用戊酸雌二醇（補(bǔ)佳樂），共21天，最后10天加服黃體酮膠囊，連續(xù)三個周期。兩種方案維持黃體方案均相同。即取卵日開始維持黃體16天（常規(guī)方案：黃體酮60mg肌注每天）。常規(guī)于取卵后第三天移植，常規(guī)移植2枚胚胎。注意若內(nèi)膜＜7mm者、OHSS高?；颊呋騂CG日血P＞4.77nmol/L者取消移植。胚胎移植日若有多余胚胎，則令患者簽署胚胎冷凍知情同意書，若遺棄胚胎須簽署胚胎遺棄同意書。移植后13天返院復(fù)查是否受孕，若妊娠則繼續(xù)黃體支持至移植后60天，若未妊娠，須休息2～3個月方可再行IVF-ET或F-ET。

1.5 臨床觀察指標(biāo) 比較兩組間基本情況如患者年齡、體重指數(shù)（BMI）、移植次數(shù)、既往移植胚胎數(shù)、移植胚胎數(shù)、囊胚數(shù)及妊娠結(jié)局，如臨床妊娠率、著床率、生化妊娠率以及繼續(xù)妊娠率。

1.6 妊娠評價 （1）胚胎著床率=探及孕囊數(shù)/移植胚胎總數(shù)；（2）生化妊娠率=血HCG增高人數(shù)/移植病人數(shù)。（HCG增高指3日齡胚胎移植后14天、5日齡胚胎移植后12天血β-hcG≥25MIU/ml）；（3）臨床妊娠率=探及孕囊的病人數(shù)/移植病人數(shù)；（4）繼續(xù)妊娠率=臨床妊娠超過20周病人數(shù)/移植病人總數(shù)。妊娠者胚胎移植45天B超查孕囊、胚芽，75天查胚胎頂臀長（CRL）、頸項透明帶厚度NT。如妊娠過程中發(fā)生流產(chǎn)，盡量做胎兒染色體核型分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理。計量資料符合正態(tài)分布用±s表示，采用t檢驗，部分不符合正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（最大值-最小值）表示，用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料指標(biāo)采用四格表，用率表示，采用χ2檢驗。檢驗水準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組患者臨床妊娠率、胚胎著床率和生化妊娠率比較，試驗組臨床妊娠率和著床率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。試驗組生化妊娠率高于對照組，但無明顯差異（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組患者臨床妊娠率、胚胎著床率和生化妊娠率比較（%）

3 討論

對于體外受精-胚胎移植患者原因不明的RIF，是輔助生殖助孕過程中的常見問題，目前國內(nèi)外均沒有療效確切的治療手段，無論是在在經(jīng)濟(jì)上還是精神上均給這些夫婦造成沉重的心理負(fù)擔(dān)，因此提高此類患者的臨床妊娠率是目前生殖領(lǐng)域?qū)＜已芯康臒狳c問題之一。反復(fù)著床失敗與諸多影響因素有關(guān)，如解剖、染色體、內(nèi)分泌失常、胚胎的遺傳或發(fā)育異常、子宮內(nèi)膜容受性、滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)功能、免疫因素、年齡等有關(guān)。但因為胚胎著床是一個極為復(fù)雜且受到多種因素影響的過程，多數(shù)原因不明，因此很難明確每一位RIF患者的確切病因。對于RIF可以找到明確原因的患者可給予對癥治療，但對于原因不明的RIF的治療目前還處于探索階段，因此沒有一種完全有效的治療方法。

環(huán)孢素A是由11個氨基酸組成的環(huán)狀多肽，屬于強(qiáng)效免疫抑制劑。臨床上主要用于肝、腎以及心臟移植的抗排斥反應(yīng)。它是土壤中一種真菌的活性代謝產(chǎn)物，主要通過與細(xì)胞漿內(nèi)的環(huán)孢親和素(Cyclophilin)結(jié)合，形成復(fù)合物，該復(fù)合物與鈣調(diào)磷酸酶催化亞單位結(jié)合，抑制其去磷酸酶活性，從而有效抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在臨床上被廣泛應(yīng)用于防治器官移植后排斥反應(yīng)和治療某些自身免疫性疾病。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)低濃度CsA（0.0001～1μmlo/L）能以濃度和時間依賴性的方式促進(jìn)妊娠早期正常人滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖，抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡，并可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲［4］。相反有學(xué)者指出高濃度CsA（10μmol/L）反而對滋養(yǎng)細(xì)胞起到抑制作用，同時CsA也可通過影響活性氧簇（ROS）的生成，抑制線粒體相關(guān)的凋亡信號通路，減少妊娠晚期滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡［5，6］。研究發(fā)現(xiàn)［7］CsA能夠通過通路MAPK/ERK1/2從而促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-9與MMP-2的基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)蛋白分泌的作用。MMP-9與MMP-2蛋白具有消化細(xì)胞外基質(zhì)膠原的作用，二者主要功能是降解和重塑細(xì)胞外基質(zhì)，繼而有益于組織細(xì)胞融合，以上兩種蛋白的表達(dá)水平對胎盤形成及子宮螺旋動脈的重塑密切相關(guān)，因此CsA促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)作用，與上面這兩種蛋白增加密切相關(guān)。李大金［8］研究組發(fā)現(xiàn)CsA誘導(dǎo)母體免疫系統(tǒng)對胚胎產(chǎn)生免疫耐受、糾正CBA/J×DBA/2流產(chǎn)小鼠（免疫性流產(chǎn)模型）胚胎吸收傾向的同時，具有促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞增生和提高其侵蝕功能的作用。人類妊娠50~60天的絨毛經(jīng)CsA處理后，滋養(yǎng)細(xì)胞增生活躍，MMP-9和MMP-2表達(dá)上調(diào)，actin基因表達(dá)上調(diào)［9］。以上證據(jù)均表明CsA對滋養(yǎng)細(xì)胞的這些作用提示它可能在輔助生殖技術(shù)中具有促進(jìn)胚胎著床的潛在價值。

本研究得出的最終結(jié)論是試驗組比對照組臨床妊娠率（43%vs 27.47%）和著床率（27.66%vs 15.25%）均高，而且二者均有明顯的差異（P＜0.05），生化妊娠率也高于對照組（46%vs 32.97%），但二者并沒有明顯的差別（P＞0.05）。

綜上所述，試驗組較對照組的臨床妊娠率和著床率均高，因此針對原因不明的反復(fù)著床失敗的女性，可以考慮優(yōu)先選擇應(yīng)用環(huán)孢素。