熊波，吳鋒

（1復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科，上海 200032；2皖南醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，蕪湖 241002）

外科手術(shù)創(chuàng)傷作為一種高強度的應(yīng)激源，可引起機體多系統(tǒng)生理功能的改變，以致影響手術(shù)的安全性，也可影響術(shù)后患者的轉(zhuǎn)歸。因此，尋找合適的方法減輕外科手術(shù)創(chuàng)傷應(yīng)激反應(yīng)和降低術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率，對患者術(shù)后恢復(fù)是很必要的。右美托咪定（dexmedetomidine, Dex）是一種新型的α2腎上腺素能受體激動劑，能抑制交感神經(jīng)興奮，產(chǎn)生有效鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用，廣泛應(yīng)用于臨床麻醉輔助用藥，并具有一定的緩解應(yīng)激的作用[1]。有研究表明，多種傷害性刺激都可誘導(dǎo)神經(jīng)源性一氧化氮合酶（nNOS）、c‐Fos和松馳素‐3（relaxin‐3）在神經(jīng)元內(nèi)表達[2‐4]。藍斑是Dex作用的主要部位，Dex能下調(diào)內(nèi)毒素休克大鼠藍斑過度表達的nNOS和c‐Fos，也能下調(diào)脾切除手術(shù)大鼠海馬CA1區(qū)c‐Fos和relaxin‐3表達[5,6]。目前尚未見Dex對脾切除手術(shù)大鼠藍斑nNOS、c‐Fos和 relaxin‐3表達影響的報道，本實驗對此進行研究，以探討外科腹部大手術(shù)創(chuàng)傷對老年大鼠的應(yīng)激機制和Dex對其的干預(yù)作用。

材料和方法

1 實驗動物與分組

清潔級18月齡雄性Sprague‐Dawley（SD）老年大鼠72只，體重500～600 g [成都簡陽達碩動物科技有限公司，許可證號：SCXK（川）2013‐74]，大鼠分籠飼養(yǎng)，每籠1只，自然光照，室溫23±2 ℃，相對濕度60%～65%，自由進食（顆粒飼料購于南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場）和飲水。72只大鼠隨機分為生理鹽水對照組（C組）、脾切除模型組（S組）、Dex低劑量+脾切除組（LD組，Dex 3 μg/kg）和Dex高劑量+脾切除組（HD組，Dex 12 μg/kg），C組和S組均注射生理鹽水2ml/kg，每組再分為1、3和7 d 3個亞組，每亞組6只。除C組外，其余各組大鼠同文獻[6]方法實施脾切除術(shù)。

2 主要試劑與藥品

Dex注射液（130621，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）；戊巴比妥鈉（WS20050411，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；兔抗relaxin‐3（1:150）（bs‐11412R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；兔抗nNOS、c‐Fos（1:150）、β‐actin（1:600，碧云天生物技術(shù)研究所）、生物素化兔抗山羊IgG（1:200，二抗）、生物素化羊抗兔IgG（1:100，二抗）、鏈酶親和素‐生物素‐過氧化物酶復(fù)合液（SABC）、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液、封閉液均購自武漢博士德生物工程有限公司）。

3 免疫組織化學(xué)染色

1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg，i.p）麻醉，斷頭取腦，用冰生理鹽水沖洗，矢狀面將腦組織分為左右兩半，左半腦置入4%多聚甲醛固定過夜，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，取藍斑部位連續(xù)冠狀切片，片厚5 μm。切片分成3套，分別用于nNOS、c‐Fos和relaxin‐3染色。切片常規(guī)脫蠟至脫水，3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸緩沖液（0.01 mol/L，pH 6.0）微波抗原修復(fù)，兔血清封閉液封閉1 h，分別滴加抗nNOS、c‐Fos和relaxin‐3一抗，4℃冰箱過夜孵育，分別滴加1:200生物素化羊抗兔IgG（nNOS和c‐Fos）和生物素化兔抗山羊IgG (relaxin‐3)，室溫孵育2 h，SABC（1:100）室溫孵育1 h，DAB顯色。以上各步后均用pH7.4的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）充分清洗（5 min×3次）。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。為了保證可比性，實驗過程中各組所用酶反應(yīng)液、反應(yīng)時間及溫度等均相同。本實驗中，用PBS代替一抗作為陰性對照，陰性對照組無表達。nNOS、c‐Fos和relaxin‐3免疫反應(yīng)產(chǎn)物均呈棕黃色或棕褐色，著色部位主要在胞體和突起的胞漿內(nèi)，細胞核不著色成空泡狀或非常淡染。每只大鼠藍斑各取3張相同部位切片，每張切片取3個細胞，每組合計54個細胞，Olympus BX51顯微鏡（Olympus公司，日本）觀察并拍片，Image J 圖像分析軟件測定nNOS、c‐Fos和relaxin‐3陽性反應(yīng)產(chǎn)物灰度值，取其平均值進行半定量分析。

4 Western blot

取右半腦的藍斑組織以RIPA裂解液提取組織總蛋白后，根據(jù)目的蛋白的分子量大小配置SDS‐PAGE凝膠，上樣后進行電泳，以濕轉(zhuǎn)方式將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉，室溫搖床搖晃2 h；加入抗nNOS和c‐Fos 抗體（稀釋度1:200）孵育，4 ℃過夜（18 h），TBST緩沖液（TBS緩沖液100 ml，加1 ml吐溫20，用蒸餾水定容至1L）洗脫3次，每次10min；加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（稀釋度1:1000），室溫孵育2 h，TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min。ECL化學(xué)發(fā)光顯色、X光膠片曝光、顯影、定影，膠片經(jīng)掃描后，將所得圖像在凝膠成像分析系統(tǒng)中測定各組大鼠藍斑中nNOS和c‐Fos及內(nèi)參（β‐actin）條帶的平均吸光度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的比值作為目的蛋白的相對表達量。

5 統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Dex抑制脾切除老年大鼠藍斑神經(jīng)元中nNOS、c-Fos和relaxin-3免疫反應(yīng)性增強

免疫組織化學(xué)染色檢測顯示：脾切除大鼠術(shù)后1 d和3 d藍斑神經(jīng)元中nNOS、c‐Fos和relaxin‐3免疫反應(yīng)性明顯增強，表現(xiàn)為免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物明顯增加，著色明顯增強；術(shù)后7 d藍斑神經(jīng)元中nNOS、c‐Fos和relaxin‐3免疫反應(yīng)性與對照組比較無明顯變化。與脾切除模型組比較，LD和HD Dex組大鼠術(shù)后1 d和3 d藍斑神經(jīng)元中nNOS、c‐Fos和relaxin‐3免疫反應(yīng)性明顯減弱，其中HD組減弱更為明顯；而術(shù)后7 d藍斑神經(jīng)元中nNOS、c‐Fos和relaxin‐3免疫反應(yīng)性各組之間無明顯差異（圖1—3）。

圖1 Dex對脾切除老年大鼠藍斑神經(jīng)元中nNOS表達影響的免疫組織化學(xué)檢測。A，藍斑中nNOS免疫組織化學(xué)染色的代表性圖像；比例尺，50 μm。B，藍斑中nNOS免疫反應(yīng)性統(tǒng)計學(xué)分析；與C組比較，*P ＜ 0.05；與S組比較，#P ＜ 0.05；與 LD組相比，△P＜ 0.05；n=6Fig.1 Immunohistochemical examination for the effect of Dex on nNOS expression in the locus coeruleus neurons of aged rats after splenectomy. A,representative images of nNOS immunohistochemical staining in the locus ceruleus; scale bar, 50 μm; B, statistical analysis of nNOS immunoreactivity in the locus coeruleus; *P ＜ 0.05 vs C group; #P ＜ 0.05 vs S group; △P ＜ 0.05 vs LD group; n=6

2 Dex下調(diào)脾切除老年大鼠藍斑nNOS和c-Fos蛋白表達水平

Western blot實驗結(jié)果顯示：與C組相比，老年大鼠術(shù)后1 d和3 d的S組藍斑nNOS和c‐Fos蛋白表達水平均明顯增加，術(shù)后7 d蛋白表達水平無顯著差異；與S組相比，術(shù)后1 d和3 d的LD、HD組nNOS和c‐Fos蛋白表達均明顯降低，而術(shù)后7 d蛋白表達水平則無明顯差異（圖4）。由此提示Dex對老年大鼠術(shù)后藍斑神經(jīng)元具有下調(diào)nNOS和c‐Fos的作用。

圖4 Dex對脾切除老年大鼠藍斑神經(jīng)元中nNOS和c‐Fos水平影響的Western blot檢測。A，藍斑中nNOS和c‐Fos水平代表性Western blot檢測結(jié)果。B，藍斑中nNOS和c‐Fos水平的統(tǒng)計學(xué)分析；與C組比較，*P ＜ 0.05；與S組比較，#P＜ 0.05；與 LD組相比，△P＜ 0.05；n=6Fig.1 Western blot detection for the effect of Dex on the levels of nNOS and c‐Fos in the locus coeruleus neurons of aged rats after splenectomy. A,representative results of the levels of nNOS and c‐Fos detected by Western blot in the locus ceruleus; B, statistical analysis of the levels of nNOS and c‐Fos in the locus coeruleus; *P ＜ 0.05 vs C group; #P＜ 0.05 vs S group; △P＜ 0.05 vs LD group; n=6

圖2 Dex對脾切除老年大鼠藍斑神經(jīng)元中c‐Fos表達影響的免疫組織化學(xué)檢測。A，藍斑中c‐Fos免疫組織化學(xué)染色的代表性圖像；比例尺，50 μm。B，藍斑中c‐Fos免疫反應(yīng)性統(tǒng)計學(xué)分析；與C組比較，*P ＜ 0.05；與S組比較，#P＜ 0.05；n=6Fig. 2 Immunohistochemical examination for the effect of Dex on c‐Fos expression in the locus coeruleus neurons of aged rats after splenectomy. A,representative images of c‐Fos immunohistochemical staining in the locus ceruleus; scale bar, 50μm; B, statistical analysis of c‐Fos immunoreactivity in the locus coeruleus; *P＜ 0.05 vs C group; #P ＜ 0.05 vs S group; n=6

討 論

我們的社會正在步入老齡化，由于醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，更多的老年患者需要接受手術(shù)治療，但老年人生理條件較特殊，一些手術(shù)，尤其是腹部大手術(shù)，對老年病人的損傷更大，更易出現(xiàn)較重的術(shù)后應(yīng)激[7]。手術(shù)作為一種特殊類型的創(chuàng)傷是外科病人中最常見的應(yīng)激源生物因素，其中手術(shù)創(chuàng)傷程度決定了機體圍手術(shù)期應(yīng)激反應(yīng)的強弱[8]。手術(shù)創(chuàng)傷越大，應(yīng)激反應(yīng)越強。本研究是對老年大鼠腹部大手術(shù)脾切除進行術(shù)后應(yīng)激可能的機制研究，具有一定的臨床意義。

Dex是一種新型的α2腎上腺素能受體激動劑，能抑制交感神經(jīng)興奮，緩解應(yīng)激，具有一定的腦保護作用，是廣泛應(yīng)用于臨床麻醉的輔助用藥[9,10]。Dex的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛而不影響呼吸的藥理特點，使其在老年患者麻醉中顯示出獨特的優(yōu)勢作用，可降低術(shù)中應(yīng)激反應(yīng)和抑制插管引起的應(yīng)激反應(yīng)，已經(jīng)越來越多地被應(yīng)用于老年患者麻醉管理[11,12]。

圖3 Dex對脾切除老年大鼠藍斑神經(jīng)元中relaxin‐3表達影響的免疫組織化學(xué)檢測。A，藍斑中relaxin‐3免疫組織化學(xué)染色的代表性圖像；比例尺，50 μm。B，藍斑中relaxin‐3免疫反應(yīng)性統(tǒng)計學(xué)分析；與C組比較，*P ＜ 0.05；與S組比較，#P ＜ 0.05； n=6Fig. 3 Immunohistochemical examination for the effect of Dex on nNOS expression in the locus coeruleus neurons of aged rats after splenectomy. A,representative images of nNOS immunohistochemical staining in the locus ceruleus; scale bar, 50 μm; B, statistical analysis of relaxin‐3 immunoreac‐tivity) in the locus coeruleus; *P ＜ 0.05 vs C group; #P＜ 0.05 vs S group; n=6

藍斑是應(yīng)激時情緒變化及行為改變的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵部位[13‐15]，也是腦干含nNOS陽性神經(jīng)元的主要部位之一[16]。nNOS催化生成的NO具有抑制和介導(dǎo)氧化損傷的雙重作用，正常范圍內(nèi)可清除機體內(nèi)多余氧自由基，減輕機體氧化應(yīng)激反應(yīng)，一旦水平升高，則會加重機體氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致腦損傷和神經(jīng)元大量死亡[17]。有研究表明，機體受到手術(shù)這種刺激，誘導(dǎo)NOS表達，NOS的激活又可誘導(dǎo)c‐Fos等轉(zhuǎn)錄因子的表達[18]，急性攻擊應(yīng)激會引起大鼠藍斑c‐Fos表達增加[19]。c‐Fos在促進藍斑激活，使其釋放去甲腎上腺素（NE）方面都起著重要的作用。從基因和蛋白質(zhì)的角度研究也表明：抑郁、電擊、免疫損傷、社會壓力等不同種類的應(yīng)激都會激活藍斑NE能系統(tǒng)，引起藍斑c‐Fos mRNA和蛋白質(zhì)表達的改變[20,21]。

Dex可降低nNOS和c‐Fos陽性神經(jīng)元表達，有實驗研究表明，大鼠在坐骨神經(jīng)結(jié)扎后熱痛閾降低，脊髓中央管周圍灰質(zhì)nNOS陽性神經(jīng)元顯著升高。注射Dex可使nNOS陽性神經(jīng)元表達顯著降低[22]。我們以前的研究也觀察到Dex對內(nèi)毒素性休克大鼠藍斑c‐Fos及藍斑和海馬結(jié)構(gòu)nNOS過高表達有明顯的下調(diào)作用[5,23]。也有作者發(fā)現(xiàn)在腦缺血模型中，Dex可以抑制創(chuàng)傷性刺激后海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)c‐Fos的表達，對神經(jīng)元有保護作用[24]。

本研究觀察到脾切除術(shù)后1 d和3 d時，藍斑nNOS和c‐Fos蛋白表達顯著增強，但術(shù)后7 d的表達與對照組相比，則無明顯差異。這與我們曾報道老年大鼠脾切除術(shù)后1 d和3 d，海馬CA1區(qū)c‐Fos表達均顯著強于對照組的結(jié)果相似[6]。這可能是老年大手術(shù)患者容易出現(xiàn)較重的術(shù)后應(yīng)激反應(yīng)的機制之一。通過使用不同劑量Dex的術(shù)前干預(yù)，可明顯降低老年大鼠脾切除術(shù)后藍斑nNOS和c‐Fos陽性神經(jīng)元表達，其原因可能是Dex對腦組織有一定的保護作用，改善腦氧代謝，由此減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)[25]。

Relaxin‐3是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，主要參與應(yīng)激反應(yīng)、攝食行為、喚醒和認知[26,27]。在創(chuàng)傷和應(yīng)激狀態(tài)下，relaxin‐3會大量過度表達，可能會產(chǎn)生神經(jīng)毒性而引起神經(jīng)元凋亡和腦損害[28]。對脾切除手術(shù)的老年大鼠POCD（Postoperative cognitive dysfunc‐tion, POCD）的研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后1 d和3 d時，海馬CA1區(qū)relaxin‐3神經(jīng)元表達明顯增加，認為relaxin‐3的過度表達可能與手術(shù)刺激的應(yīng)激引起神經(jīng)元過度興奮、誘發(fā)興奮毒性有關(guān)，其神經(jīng)毒性可使凋亡蛋白表達增加，抗凋亡蛋白表達減少，促進海馬結(jié)構(gòu)神經(jīng)元凋亡，這可能是老年大鼠產(chǎn)生POCD的機制之一。同時我們也觀察到Dex可能通過抑制老年大鼠術(shù)后海馬結(jié)構(gòu)的過度激活，減少relaxin‐3表達，而降低POCD的發(fā)生[6]。本研究采用免疫組織化學(xué)方法觀察到，脾切除術(shù)后1 d和3 d藍斑的relaxin‐3表達均較對照組顯著增強。這也可能是脾切除術(shù)后應(yīng)激的機制之一。Dex降低老年大鼠脾切除術(shù)后藍斑relaxin‐3表達的確切機制則尚需進一步研究。

綜上所述，老年大鼠脾切除術(shù)后藍斑nNOS、c‐Fos和relaxin‐3的表達顯著增加，Dex可顯著降低藍斑nNOS、c‐Fos和relaxin‐3的表達。這可能是Dex降低手術(shù)創(chuàng)傷應(yīng)激的重要機制之一。