王彥利，師愛青，張咸虎

（焦作煤業(yè)集團有限責(zé)任公司中央醫(yī)院麻醉科，焦作 454000）

肝缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷是一種常見的臨床并發(fā)癥，經(jīng)常發(fā)生在肝移植、肝切除、休克和創(chuàng)傷后，其可導(dǎo)致器官功能受損甚至衰竭[1]。因此，臨床上急需解決這一問題。

肝缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）損傷包括細(xì)胞缺氧損傷和再氧合誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性反應(yīng)的兩個過程[2]。細(xì)胞處于無氧代謝時，可導(dǎo)致各種肝細(xì)胞功能障礙[3]。肝組織缺氧后再氧合后產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），這進(jìn)一步加重肝細(xì)胞損傷[4]。實驗證據(jù)表明，肝細(xì)胞損傷通常伴有肝細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡，這是肝I/R損傷期間肝細(xì)胞死亡的主要原因[5,6]。TRLs是先天免疫反應(yīng)中最具代表性的受體之一，Toll樣受體‐4（toll‐like receptor 4，TLR4）能夠識別并結(jié)合病原微生物或宿主標(biāo)記細(xì)胞死亡表面的特定分子結(jié)構(gòu)，如病原體相關(guān)的分子模式和損傷相關(guān)的分子模式[7]。TLR4在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和實質(zhì)肝細(xì)胞中均有表達(dá)[8,9]。TLR4信號包括兩個經(jīng)典的級聯(lián)：髓樣分化因子‐88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴途徑和非依賴途徑，激活后可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10,11]。TLR4觸發(fā)的固有免疫反應(yīng)可引起肝H/R損傷[12]。異氟烷（isoflurane，ISO）是臨床中最常應(yīng)用的全身麻醉藥，已有研究[13]報道，異氟烷預(yù)處理對肝I/R損傷有保護作用，但具體機制尚不清楚。因此，基于目前關(guān)于TLR4、MyD88參與的細(xì)胞凋亡和ISO的肝保護作用的知識，本研究旨在一步評估ISO預(yù)治療在肝I/R損傷中的肝保護特性和潛在的作用機制。

材料和方法

1 主要試劑

正常人肝細(xì)胞系（HL‐7702，中科院上海細(xì)胞庫）；10%胎牛血清（FBS）、RPMI‐1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；MTT試劑盒（江蘇凱基生物科技公司）；LDH檢測試劑盒和DAPI試劑（上海碧云天生物技術(shù)公司）；細(xì)胞內(nèi)ROS測定試劑盒（美國Sigma‐Aldrich）；TUNEL檢測試劑盒（美國Roche公司）；兔抗FADD、TLR4、MyD88及TRAF6抗體（武漢三鷹生物技術(shù))；辣根過氧化物偶聯(lián)的羊抗兔IgG和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)公司）。

2 細(xì)胞培養(yǎng)

將HL‐7702接種于含有10% FBS和抗生素（100U/ mL青霉素和100 μg/ mL鏈霉素）的RP‐MI‐1640培養(yǎng)基中，放在37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3 H/R模型建立

缺氧處理前將培養(yǎng)液換為無血糖/血清培養(yǎng)液，然后在缺氧培養(yǎng)箱（含1%O2、94%N2和5%CO2）培養(yǎng)4 h，然后向培養(yǎng)液添加血糖/血清并放在正常環(huán)境（含95%空氣和5%CO2）復(fù)氧培養(yǎng)4 h。

4 實驗分組

將細(xì)胞分為對照組（Con）、H/R組和不同濃度處理的ISO組。HR組經(jīng)4 h缺氧和4 h復(fù)氧處理；ISO預(yù)處理組分別經(jīng)不同濃度ISO（0.5%、1%、1.5%）預(yù)處理20 min后，進(jìn)行4 h缺氧和4 h復(fù)氧處理。收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實驗。

5 細(xì)胞活性測定

通過MTT法檢測細(xì)胞活性。將肝細(xì)胞分別以1×104細(xì)胞/孔的密度接種到96孔板中。用不同濃度的ISO預(yù)處理后的肝細(xì)胞放置于H/R條件下培養(yǎng)。然后在每個孔板中加入0.5%MTT試劑，孵育4 h后，去除上清液，在室溫下加入100 μL二甲基亞砜（DMSO）溶解晶體。然后使用酶標(biāo)儀測定570 nm處吸光度值。

6 LDH活性檢測

參照試劑盒說明，使用LDH檢測試劑盒檢測細(xì)胞LDH活性。即經(jīng)規(guī)定條件處理后，分別取各組120 μL細(xì)胞上清液，并加入到96孔板中，加入60 μL LDH檢測溶液，避光孵育30 min后，測量溶液在490 nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算LDH水平。

7 ROS水平檢測

用ROS熒光探針法測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。收集各組細(xì)胞并用完全培養(yǎng)基制作細(xì)胞密度為1×106個/ mL懸液，各取500 μL細(xì)胞懸液加入到1.5 mL EP管中，并加入10 μL染色劑檢測工作液，37℃避光培養(yǎng)30 min，加入10 μL染色保存液。每組取10 μL已染色的細(xì)胞懸液加到載玻片上，蓋上蓋玻片，熒光顯微鏡（德國徠卡Leica DM6000B）下（λex= 650 nm，λem = 675 nm）定性觀察并拍照。每組取400 μL已染色的細(xì)胞懸液加到1 mL比色杯中，使用熒光分光光度計（日本Hitachi F‐7000）（λex= 650 nm，λem = 675 nm）定量檢測細(xì)胞相對熒光單位（熒光強度）。

8 細(xì)胞凋亡TUNEL染色法檢測

制作細(xì)胞涂片，按照TUNEL檢測試劑盒說明進(jìn)行TUNEL染色，細(xì)胞核用DAPI染色10 min。用熒光顯微鏡拍攝TUNEL陽性肝細(xì)胞和總肝細(xì)胞的數(shù)量，并應(yīng)用Image Pro Plus軟件測定細(xì)胞凋亡比例。

9 蛋白印跡分析

參照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析[14]。使用以下抗體：FADD（1:1000稀釋）、TLR4（1:3000稀釋）、MyD88（1:2000稀釋）以及TRAF6（1:4000稀釋）。隨后用TBS‐T洗膜，再與辣根氧化物酶（HRP）的二抗孵育1 h。加入ECL發(fā)光液使蛋白條帶可視化。使用Image J軟件檢測條帶的光密度值分析印跡。

10 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 19.0分析軟件進(jìn)行所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差。多組間均數(shù)比較采用方差分析。P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 異氟烷抑制缺氧/復(fù)氧所致肝細(xì)胞活性降低和LDH活性升高

應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞活力及應(yīng)用LDH試劑盒檢測LDH活性顯示：與Con組相比，H/R組肝細(xì)胞活性顯著降低，LDH活性顯著升高；與H/R組比較，不同劑量ISO治療組的肝細(xì)胞活性隨著ISO濃度升高呈現(xiàn)劑量依賴性增加，LDH活性隨著ISO濃度升高呈現(xiàn)劑量依賴性降低（圖1）。

圖1 異氟烷對缺氧/復(fù)氧損傷HL‐7702細(xì)胞的細(xì)胞活性和LDH活性的影響。A，細(xì)胞活性（MTT法檢測）統(tǒng)計學(xué)分析；B， LDH活性（LDH檢測試劑盒法）統(tǒng)計學(xué)分析。與Con組比較：###P＜0.001；與H/R組比較：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；n=5Fig.1 Effects of isoflurane on cell viability and LDH activity in HL‐7702 cells injured by hypoxia/reoxygenation; A, statistical analysis of cell viability assayed with MTT method; B, statistical analysis of LDH activity assayed with LDH kit method. ###P＜0.001, compared with Con group; *P＜0.05,**P＜0.01, ***P＜0.001, compared with H/R group; n=5

2 異氟烷降低H/R肝細(xì)胞內(nèi)ROS水平

應(yīng)用ROS熒光探針檢測ROS水平顯示：H/R肝細(xì)胞組產(chǎn)生的ROS明顯高于Con組，ISO可減少H/R誘導(dǎo)的肝細(xì)胞ROS的生成，且其作用呈劑量依賴性，其中1.5%ISO效果最佳（圖2）。

圖2 異氟烷對缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)HL‐7702細(xì)胞ROS生成的影響。A，ROS熒光探針法測定ROS水平的熒光顯微鏡圖像；比例尺，25μm。B，分光光度計法檢測ROS水平的統(tǒng)計學(xué)分析。與Con組比較：###P＜0.001；與H/R組比較：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；n=5Fig. 2 Effect of isoflurane on hypoxia/reoxygenation injury‐induced ROS production in HL‐7702 cells. A, fluorescence microscopic images of ROS level measured by ROS fluorescence probe method; scale bar, 25 μm. B, statistical analysis of ROS level detected by spectrophotometry. ###P＜0.001,compared with Con group; *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, compared with H/R group; n=5.

3 異氟烷抑制H/R肝細(xì)胞的凋亡

應(yīng)用TUNEL試劑盒染色顯示：H/R組HL‐7702細(xì)胞凋亡率明顯高于Con組，ISO可對H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡產(chǎn)生劑量依賴性抑制作用，其中1.5% ISO組抑制效應(yīng)最強（圖3）。

圖3 異氟烷對缺氧/復(fù)氧損傷誘導(dǎo)的HL‐7702細(xì)胞凋亡的影響。A，TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡；綠色為TUNEL染色的凋亡細(xì)胞，藍(lán)色為DAPI染色的細(xì)胞核；比例尺，25μm；B， TUNEL陽性細(xì)胞比例統(tǒng)計學(xué)分析。與Con組比較：###P＜0.001；與H/R組比較：**P＜0.01，***P＜0.001；n=5Fig. 3 Effects of isoflurane on apoptosis of HL‐7702 cells induced by hypoxia/reoxygenation injury. A, TUNEL staining assay for cell apoptosis, apop‐totic cells stained green and nuclei stained blue by DAPI; scale bar, 25 μm. B, statistical analysis of percentage of TUNEL‐positive cells. ###P＜0.001,compared with Con group; **P＜0.01, ***P＜0.001, compared with H/R group; n=5

4 異氟烷抑制缺氧/復(fù)氧損傷肝細(xì)胞TLR4、FADD、MyD88、TRAF6水平的上調(diào)

Western blot檢測顯示：H/R組HL‐7702細(xì)胞內(nèi)TLR4、FADD、MyD88、TRAF6水平顯著高于Con組，ISO處理可顯著抑制H/R所致的TLR4、FADD、MyD88、TRAF6水平升高（圖4）。

圖4 異氟烷對缺氧/復(fù)氧損傷HL‐7702細(xì)胞中TRL4、FADD、MyD88、TRAF6水平的影響。A，TRL4、FADD、MyD88、TRAF6水平代表性Western blot檢測結(jié)果；B，TRL4水平的統(tǒng)計學(xué)分析；C，F(xiàn)ADD水平的統(tǒng)計學(xué)分析；D，MyD88水平的統(tǒng)計學(xué)分析；E，TRAF6水平的統(tǒng)計學(xué)分析。與Con組比較：###P＜0.001；與H/R組比較：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；n=5Fig. 4 Effects of isoflurane on the levels of TLR4, FADD, MyD88 and TRAF6 in HL‐7702 cells injured by hypoxia/reoxygenation injury. A, representa‐tive Western blot test results of the levels of TLR4, FADD, MyD88 and TRAF6; B, statistical analysis of relative levels of TRL4; C, statistical analysis of relative levels of FADD; D, statistical analysis of relative levels of MyD88; E, statistical analysis of relative levels of TRAF6. ###P＜0.001, compared with Con group; *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001, compared with H/R group; n=5

討 論

肝I/R損傷是構(gòu)成全球肝移植、肝切除、休克和創(chuàng)傷后治療失敗的主要原因。肝細(xì)胞凋亡是肝I/R損傷的典型特征。肝缺血很快就會引起細(xì)胞凋亡，再灌注后就會進(jìn)一步惡化。有證據(jù)[15]表明，抑制細(xì)胞凋亡過程可減少I/R引起的肝損傷，并降低肝衰竭的風(fēng)險。因此，抑制凋亡是減輕肝I/R損傷有效的干預(yù)措施。

在本研究中，我們評估了ISO在肝細(xì)胞I/R模型中的潛在作用，結(jié)果表明，ISO處理可以增加H/R細(xì)胞的存活率，并降低血清LDH水平和細(xì)胞凋亡。目前，普遍認(rèn)為再灌注期的損傷程度比缺血期更嚴(yán)重，因為在再灌注過程中中產(chǎn)生了大量的ROS。這些ROS可直接損害肝組織，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、血管擴張甚至造成器官衰竭[4]。此外，ROS還會觸發(fā)機體中炎性介質(zhì)的釋放，進(jìn)一步損傷細(xì)胞[16]。本研究顯示，ISO可以減少ROS的生成，減輕肝細(xì)胞損引起細(xì)胞氧化應(yīng)激，表明ISO預(yù)防肝損傷的至少有部分原因是其抗氧化性。

為了評估ISO對H/R導(dǎo)致的肝細(xì)胞損傷的機制，我們進(jìn)一步分析了死亡受體通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。死亡受體通路是三大細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，死亡受體在器官中普遍表達(dá)，肝細(xì)胞及膽管細(xì)胞對死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡尤其敏感。TLR4作為在體內(nèi)普遍表達(dá)的死亡受體需要與FADD結(jié)合引發(fā)細(xì)胞凋亡[17]。FADD是死亡受體通路上一種死亡域蛋白，細(xì)胞接收到凋亡信號后，配體與死亡受體結(jié)合后吸引FADD，在細(xì)胞膜上形成凋亡誘導(dǎo)復(fù)合物，從而激活caspase 8，進(jìn)而引起隨后的級聯(lián)反應(yīng)，細(xì)胞發(fā)生凋亡。TLR4廣泛存在于肝臟的許多類型的細(xì)胞中，并被證明與肝臟H/R損傷的進(jìn)展有關(guān)[18]。TLR4信號包括兩個經(jīng)典的級聯(lián)：MyD88依賴途徑和非依賴途徑，激活后可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[10,11]。TRAF6是腫瘤壞死因子（TNF）超家族和Toll樣/白細(xì)胞介素‐1受體（Toll‐/IL‐1receptor，TIR）超家族的重要接頭分子，LTR4被激活后，TRAF6同時介導(dǎo)MyD88依賴性與非依賴信號通路[19]。本研究表明，ISO能抑制H/R誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中TLR4、MyD88、FADD和TRAF6表達(dá)水平增加。本研究提供了一個關(guān)于TLR4/MyD88信號通路和ISO抑制I/R損傷肝細(xì)胞導(dǎo)致的凋亡之間的新的聯(lián)系。

總之，ISO能抑制肝H/R造成的肝細(xì)胞損傷，其機制包括減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激以及下調(diào)TLR4、MyD88、FADD和TRAF6來減少細(xì)胞死亡來保護肝細(xì)胞免受H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。因此，在肝外傷手術(shù)的麻醉中應(yīng)用ISO可能是預(yù)防肝H/R損傷的重要策略。