樊巍，熊震

（1陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，重慶 400038；2重慶市紅十字會醫(yī)院（江北區(qū)人民醫(yī)院）感染科，重慶 400020）

矽肺是由于長期大劑量暴露于二氧化硅（SiO2）粉塵而引起的一種以肺部炎癥和纖維化為主要病理特點的職業(yè)病。矽肺預(yù)后較差，晚期以肺間質(zhì)重度纖維化和呼吸衰竭為主要癥狀，極易導(dǎo)致死亡。由于工業(yè)化造成的礦場環(huán)境中大氣污染和SiO2粉塵顆粒彌散等原因，近年來矽肺發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。目前矽肺屬于進(jìn)行性肺疾病，且其具體機(jī)制并不完全清楚，目前尚無特效藥物[2]。SiO2粉塵可被肺中的巨噬細(xì)胞吞噬，形成矽結(jié)節(jié)并累及肺泡，釋放促炎性介質(zhì)、氧自由基及促纖維化因子等，誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞增殖、分化并分泌膠原蛋白，最終導(dǎo)致纖維化形成[3,4]。這種病理改變還增加患者心衰的發(fā)病風(fēng)險，嚴(yán)重影響著患者生活質(zhì)量[2,5]。因此，探索新的藥物來抑制矽肺進(jìn)展尤為迫切。

銀杏葉提取物761（Ginkgo biloba Extract 761，EGb761）是從銀杏葉中提取的一種具有抗炎、抗氧化和抗動脈硬化的銀杏內(nèi)酯類黃酮化合物[6]，目前已經(jīng)應(yīng)用于心血管類疾病的治療。另外，近年來通過動物模型發(fā)現(xiàn)，EGb761具有緩解腎纖維化、肝纖維化和肺纖維化的作用[7‐9]。EGb761對矽肺的作用的研究尚少，本研究利用SiO2氣管灌注法構(gòu)建矽肺大鼠模型，給予EGb761干預(yù)，通過觀察肺部病理形態(tài)改變的狀況，來評估其作為抗矽肺的潛力并分析其機(jī)制。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物

6~7周齡雄性SD大鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所[許可證號：SCX‐K(渝)2017‐0005]，飼養(yǎng)于SPF動物房，并控制溫度（23~25°C）、相對濕度（45%~65%）和光照（12 h光照循環(huán)）。所有大鼠可自由攝食飲水。飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。

1.2 主要實驗試劑

SiO2顆粒（純度＞99.9%；貨號：85356）購自美國Sigma公司；EGb761購自廣州和博生物科技有限公司；大鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor‐α，TNF‐α）（貨號：SEA133Ra）和白介素6（interleukin 6，IL‐6）（貨號：SEA079Ra）ELISA試劑盒購自武漢云克隆科技股份有限公司；大鼠IL‐1β ELISA試劑盒（貨號：SBJ‐R0546）和Van Gieson（VG）染色試劑盒（貨號：SBJ‐0297）購自南京森貝伽生物科技有限公司；HE染色試劑盒（貨號：G1120）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：PC0020）、ECL Plus超敏發(fā)光液（貨號：PE0010）、小鼠抗β‐actin單克隆抗體（貨號：K200058M）和免疫組織化學(xué)染色試劑盒（貨號：SP0041）購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）多克隆抗體（貨號：ab125943）和小鼠抗α‐平滑肌肌動蛋白（α‐smooth muscle actin，α‐SMA）單克隆抗體（貨號：ab7817）購自英國Abcam公司；兔抗I型膠原蛋白（type I collagen，COL I）多克隆抗體（貨號：14695‐1‐AP）和兔抗纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）多克隆抗體（貨號：15613‐1‐AP）購自美國Proteintech公司；過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠和抗兔二抗購自上海碧云天生物科技有限公司。

2 方法

2.1 矽肺大鼠模型構(gòu)建及分組

只大鼠分為空白對照組（Control）、EGb761高劑量對照組（Control+EGb761‐H）、矽肺模型組（SiO2）、低劑量EGb761處理組（SiO2+EGb761‐L），中劑量EGb761處理組（SiO2+EGb761‐M），高 劑量EGb761處理組（SiO2+EGb761‐H），每組5只?？瞻讓φ战M大鼠不進(jìn)行處理，直接飼養(yǎng)；EGb761對照組大鼠每日按照灌胃給藥方式給予大鼠100 mg/kg EGb761，持續(xù)4周；按照參考文獻(xiàn)[10]方法，矽肺模型組大鼠給予50 mg/mL SiO2懸液氣管內(nèi)灌注（SiO2顆粒氣管灌注前先研磨0.5 h，加水制備成50 mg/mL懸液，然后用注射器氣管灌注1 mL）后，繼續(xù)飼養(yǎng)4周；低、中和高劑量EGb761處理組大鼠分別在給予SiO2氣管灌注后1 d起，每天再分別灌胃給予20、50和100 mg/kg EGb761，持續(xù)4周。

2.2 肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察

麻醉處死各組大鼠，取肺組織用石蠟包埋。按照HE染色試劑盒說明書，取各組大鼠肺石蠟切片（6 μm厚），脫蠟至水化后，用蘇木素溶液染色5 min，自來水沖洗2 min，鹽酸乙醇分色約5 s，自來水沖洗10 min，伊紅溶液染色3 min，依次常規(guī)脫水、透明和中性樹膠封片后，用顯微鏡拍攝肺組織的HE染色圖像。按照VG染色試劑盒說明書，取各組大鼠肺石蠟切片（6 μm厚），脫蠟至水化后，Weight鐵蘇木素溶液染色5 min，自來水沖洗1 min，鹽酸乙醇分色約2 s，自來水沖洗10 min，VG溶液染色2 min，用濾紙吸除多余溶液，95%乙醇快速分化脫水，無水乙醇脫水，二甲苯透明和中性樹膠封片后，用顯微鏡拍攝肺組織的VG染色圖像。

2.3 ELISA檢測

取各組大鼠的肺組織在冰上勻漿后，12000 r/min離心10 min收集上清液。上清液先用BCA法測蛋白濃度后，然后根據(jù)大鼠TNF‐α、IL‐6和IL‐1β ELISA試劑盒說明書，用ELISA法檢測上清液中TNF‐α、IL‐6和IL‐1β含量，最后根據(jù)上清液中的蛋白濃度對上清液中TNF‐α、IL‐6和IL‐1β含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

2.4 免疫組織化學(xué)染色

取各組大鼠的肺石蠟切片（6 μm厚）在脫蠟至水化后，用3%H2O2浸泡切片10 min以除去內(nèi)源性的過氧化氫酶，并用清水洗滌2次后，用煮沸檸檬酸緩沖液浸泡2 min以修復(fù)抗原。用PBS洗滌2次后，用10%BSA組織封閉液封閉30 min后，分別室溫孵育一抗α‐SMA和CTGF（均1:300）、COL Ⅰ和FN（均1:200）2 h。用PBS洗滌3次后，室溫孵育生物素標(biāo)記的抗小鼠或抗兔抗體（二抗）（1:200）45 min；再次用PBS洗滌3次后，室溫孵育過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素（1:200）45 min。用PBS洗滌3次后，用DAB顯色液顯色后用蘇木精復(fù)染，然后自來水沖洗后，一次經(jīng)脫水、透明和封片后，用顯微鏡觀察。

2.5 Western blot檢測

取各組大鼠肺臟組織，采用RIPA裂解液萃取全蛋白。采用BCA法將各組蛋白樣品定量至相同濃度后，取35 μg蛋白進(jìn)行SDS‐聚丙烯酰胺凝膠電泳。并將電泳后的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。之后，利用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h并以1:2000的稀釋比例孵育一抗體（α‐SMA、COLI和FN）， 4 °C過夜。次日，以TBST洗滌后以過氧化物酶標(biāo)記的抗兔和抗小鼠二抗（1:2000）室溫孵育1 h，以TBST洗滌后利用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并利用Graphpad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。多組數(shù)據(jù)均數(shù)的兩兩比較，采用單因素方差分析后LSD法。P＜0.05時的差異被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 EGb761可緩解矽肺大鼠肺組織病理學(xué)變化

HE和VG染色結(jié)果（圖1）顯示，空白對照組和EGb761對照組的肺組織形態(tài)正常；矽肺模型組的肺組織呈現(xiàn)矽結(jié)節(jié)，且在矽結(jié)節(jié)周圍伴有炎細(xì)胞浸潤、肺泡損傷和大量的膠原沉積，出現(xiàn)較多不規(guī)則的肺泡間隔；高、中和低劑量EGb761處理組SiO2誘導(dǎo)的上述病理改變均明顯減輕，且以高劑量組緩解程度最為明顯。

圖1 EGb761對矽肺大鼠肺組織病理學(xué)變化的影響。HE‐L，HE染色低倍圖；HE‐H，HE染色高倍圖（低倍圖中方框區(qū)域放大）；SN，矽結(jié)節(jié)；箭頭指示炎性細(xì)胞Fig. 1 Effect of EGb761 on pathological changes in the lung tissue of silicosis rats. HE‐L, low power image with HE staining; HE‐H, high power image with HE staining (enlargement of the box areas in low power images). SN, silicotic nodule; arrows indicate inflammatory cells

2 EGb761降低矽肺大鼠肺組織中促炎細(xì)胞因子水平

為了檢測SiO2誘導(dǎo)肺纖維化過程中的炎癥情況，本研究采用ELISA檢測大鼠肺臟組織的促炎細(xì)胞因子IL‐6、IL‐1β和TNF‐α表達(dá)水平，結(jié)果顯示，矽肺模型組肺組織中IL‐6、IL‐1β和TNF‐α的表達(dá)水平較空白對照組均增高，EGb761處理能降低SiO2誘導(dǎo)的肺組織中上述3種蛋白的表達(dá)，且以高劑量組效果最為明顯（圖2）。

圖2 EGb761抑制矽肺大鼠肺組織中促炎細(xì)胞因子IL‐6、IL‐1β和TNF‐α的水平。與空白對照組比較：*P＜0.001；與模型組比較：#0.01＜P＜0.05，##0.001＜P＜0.01，###P＜0.001；n=5Fig. 2 The inhibitory effect of EGb761 on the level of pro‐inflammatory factors IL‐6, IL‐1β and TNF‐α in the lung tissues of silicosis rats. *P＜0.001,compared with normal control group; #0.01＜P＜0.05, ##0.001＜P＜0.01, ###P＜0.001, compared with model group; n=5

3.1 EGb761降低矽肺大鼠肺組織中α‐SMA水平

α‐SMA是肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物，肺成纖維細(xì)胞集聚能異常過量合成和分泌膠原蛋白，導(dǎo)致肺纖維化[11]。免疫組織化學(xué)和Western blot檢測（圖3）顯示，空白對照組和EGb761對照組的肺組織中α‐SMA水平無明顯差異；相對于空白對照組，矽肺模型組的肺組織中α‐SMA水平明顯增高，而EGb761處理可明顯抑制矽肺大鼠肺組織中α‐SMA水平的增高，以高劑量組效果更為明顯。

圖3 EGb761對矽肺大鼠肺組織中α‐SMA水平的影響。A，α‐SMA水平的代表性免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。B，α‐SMA水平的代表性Western blot檢測與統(tǒng)計學(xué)分析；與空白對照組比較：*P＜0.001；與模型組比較：#0.01＜P＜0.05，##0.001＜P＜0.01，###P＜0.001；n=5Fig.3 Effect of EGb761 on the level of α‐SMA in the lung tissues of silicosis rats. A, rep‐resentative immuno‐histochemical staining results of α‐SMA; B,representative West‐ern blotting results and statistical anal‐ysis of α‐SMA level;*P＜0.001, compared with normal control group; # 0.01＜P＜0.05,## 0.001＜P＜0.01, ###P＜0.001, compared with model group; n=5

3 EGb761降低矽肺大鼠肺組織中纖維化相關(guān)蛋白水平

COLI、FN和CTGF在肺纖維化發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[12]，免疫組織化學(xué)染色和Western blot分析（圖4）顯示，矽肺模型組肺組織中COLI、FN和CTGF水平較空白對照組均增高，EGb761處理能降低SiO2誘導(dǎo)的肺組織中這3種蛋白的增高，且以高劑量組效果更為明顯。

圖4 EGb761對矽肺大鼠肺組織中COLI、FN和CTGF水平的影響。A，COLI、FN和CTGF水平的代表性免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果。B，COLI、FN和CTGF水平的代表性Western blot檢測結(jié)果；C、D和E，COLI（C）、FN（D）和CTGF（E）水平的統(tǒng)計學(xué)分析；與空白對照組比較：*P＜0.001；與模型組比較：#0.01＜P＜0.05，##0.001＜P＜0.01，###P＜0.001；n=5Fig. 3 Effect of EGb761 on the level of COLI, FN and CTGF in the lung tissues of silicosis rats. A, representative immunohistochemical staining results of COLI, FN and CTGF; B, representative Western blotting results of COLI, FN and CTGF level; C, D and E, statistical analysis of the level of COLI(C), FN (D) and CTGF (E); *P＜0.001, compared with normal control group; #0.01＜P＜0.05, ##0.001＜P＜0.01, ###P＜0.001, compared with model group;n=5

討 論

矽肺是世界尤其是發(fā)展中國家重要的健康問題，其形成的主要原因是由于長期暴露于SiO2粉塵的職業(yè)環(huán)境中，導(dǎo)致的肺部炎細(xì)胞活化及浸潤、硅肺結(jié)節(jié)逐漸形成，進(jìn)而引起肺功能受損和進(jìn)行性纖維化[1]。目前尚無有效治療措施[2]。EGb761已被證實其在動物模型的腎、肝和肺中具有抗炎及抗纖維化作用[7‐9]，而其在矽肺中的作用尚不完全清楚。本實驗利用氣管內(nèi)灌注SiO2粉末來建立大鼠矽肺模型，并利用EGb761干預(yù)，發(fā)現(xiàn)EGb761能有效的緩解SiO2導(dǎo)致的大鼠肺部炎癥及纖維化，提示EGb761可能是潛在的矽肺防護(hù)劑。

有研究[11]證實，異常活化增多的肺肌成纖維細(xì)胞過量合成和分泌的膠原蛋白會導(dǎo)致肺纖維化的形成。因此，本研究首先檢測了肺肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物α‐SMA和與肺纖維化相關(guān)的COLI和FN，發(fā)現(xiàn)EGb761能抑制SiO2誘發(fā)的肺肌成纖維細(xì)胞的集聚與COLI的沉積并降低FN的表達(dá)水平。CTGF是一種富含半胱氨酸的細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)分泌蛋白，在正常組織中表達(dá)量較低，但在纖維化的組織中顯著上調(diào)[12,13]；因此，CTGF也被認(rèn)為是膠原沉積和肺纖維化的病理標(biāo)志物。有研究[14]表明，CTGF是TGF‐β下游因子，激活后可刺激成纖維細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其分泌和合成膠原蛋白。許多證據(jù)均表明CTGF、TGF‐β及FN在肺纖維化形成與進(jìn)展中呈協(xié)同作用[12,14,15]。本研究同樣顯示，EGb761能抑制SiO2誘發(fā)的CTGF過度表達(dá)。炎性反應(yīng)在肺纖維化形成和進(jìn)展過程中也起著重要的促進(jìn)作用。有研究[15]表明，TGF‐α可促進(jìn)成肺纖維細(xì)胞分化，且可促進(jìn)其分泌COLI和FN。IL‐6和IL‐1β也被發(fā)現(xiàn)是炎癥和纖維化的前驅(qū)因子[16,17]。另外，TGF‐α可促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞中IL‐6和IL‐1β表達(dá)，且IL‐6和IL‐1β在動物模型和人的肺纖維化的組織中均被發(fā)現(xiàn)其顯著升高[18]。本研究表明，EGb761可緩解由SiO2導(dǎo)致的肺的促炎因子TGF‐α、IL‐6和IL‐1β水平的升高。以上結(jié)果進(jìn)一步證實了EGb761具有緩解SiO2誘發(fā)矽肺中的炎性反應(yīng)和纖維化的作用。

綜上，本研究證實了EGb761對SiO2誘導(dǎo)的矽肺具有緩解作用，其機(jī)制可能包括其具有緩解SiO2誘導(dǎo)的肺部的炎性反應(yīng)以及肺成纖維細(xì)胞集聚和下調(diào)纖維化前驅(qū)蛋白的合成與分泌的作用。因此，EGb761具有臨床上治療矽肺的潛力。