李思媛 鄭娟 翟玉喜 顧明亮 高建魯

青光眼是一種以視神經(jīng)損傷和相應視功能損害為特征的視神經(jīng)疾病，是僅次于白內(nèi)障的致盲性疾病。全球約有6050萬原發(fā)性開角型青光眼(primary open-angle glaucoma,POAG)患者，到2020年該病患者的數(shù)量將達7960萬[1]。POAG的發(fā)病機制目前普遍認為是基因與環(huán)境等多種因素相互作用導致的疾病[2]。迄今，通過對符合孟德爾遺傳的青光眼家系進行連鎖分析，定義了20多個青光眼遺傳位點，并鑒定了可能的青光眼致病基因[3]。對于大多數(shù)青光眼家系，其受累個體往往在成年后發(fā)病，具有延遲發(fā)病和不完全外顯的特點。通過數(shù)十年模式生物的研究，已經(jīng)證明表觀遺傳機制對基因組功能的調(diào)控具有重要作用[4]，包括組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾、胞嘧啶(C)甲基化和non-coding RNA的調(diào)節(jié)等[5]。甲基化的特點是DNA 序列不發(fā)生改變的情況下調(diào)控基因的表達，調(diào)節(jié) DNA 重組、保證染色體完整性和某些基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性[6]。本研究通過分析一個POAG家系，確定其致病基因，并分析基因和表型的關系，初步探測基因甲基化修飾對遲發(fā)性的意義。

資料與方法

一、一般資料

獲得一個呈孟德爾顯性遺傳模式的POAG家系的血樣本及臨床資料(標準為邯鄲眼科研究標準，所有樣本由聊城市人民醫(yī)院提供，研究通過倫理委員會的審查，所有受試者均簽署知情同意書)。該家系符合“孟德爾遺傳青光眼家系較適合連鎖分析”的要求，共81例，生存78例，其中患者10例(圖1)。

圖1 POAG家系成員組成及受累情況

表1 家系部分患者的臨床資料

二、POAG診斷標準

1.有青光眼性視盤損害和(或)視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層缺損；

2.青光眼性視野缺損；

3.前房角開放，具有以上3項并排除繼發(fā)性開角型青光眼。僅眼壓大于21 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)或青光眼激發(fā)試驗(如飲水試驗和暗室俯臥試驗)陽性應診斷為可疑。

三、方法

1.臨床資料收集：詳細詢問該家系家族史(已故者信息詢問其家庭成員獲得)，并進行詳細的眼科專科檢查，包括視力、眼壓、裂隙燈顯微鏡檢查、房角鏡檢查、眼前節(jié)照相、眼底檢查及Humprey視野檢查、海德堡視網(wǎng)膜斷層掃描儀(Heidelberg retinal tomography II,HRT-II)。

2.DNA的提取：抽取家系成員靜脈血5 ml，EDTA抗凝，-4 ℃保存，采用氯仿法提取外周血細胞DNA，-80 ℃保存。

3.致病基因檢測：對該家系所有成員進行致病基因檢測。應用芯片捕獲測序技術，捕獲POAG相關基因所有的外顯子及剪切位點，通過高通量測序檢測這些基因的突變情況，對于高通量測序中出現(xiàn)的可疑致病位點，再行Sanger測序驗證。

4.檢測家系外周血中MYOC甲基化水平：使用MethPrimer http://www.uro-gene.org/methprimer預測致病基因啟動子CPG島，設計甲基化引物，重硫酸鹽處理全基因組DNA，一代測序檢測DNA甲基化程度，并行聚類分析。

結 果

一、家系基本情況

該家系共5代，81人，其中患者12人(已故2人。5代中最年輕的一代尚未出現(xiàn)表型，其余均有患者出現(xiàn)，發(fā)病年齡在15～38歲，具有遲發(fā)性特點。

二、家系患者眼部情況及特點

先證者，家系編號II-3，女，48歲，確診時間為34歲。間斷降眼壓藥物治療(卡替洛爾滴眼液、布林佐胺滴眼液，2年前加用曲伏前列素滴眼液)，眼壓控制欠佳，視野右眼為管狀視野，C/D=1.0，左眼弓形缺損，C/D=0.3。因視野損失逐漸加重，于2017年行雙眼小梁切除術。部分家系患者現(xiàn)在眼部情況及治療結果(表1)。

根據(jù)家系成員青光眼確診時間，考慮為青少年型青光眼，確診時均行視野檢查，提示有視野缺損，嚴重者雙眼無光感；眼壓在多種藥物及手術和選擇性激光小梁成形術的控制下，均在正常范圍。隨著年齡增長，家系內(nèi)發(fā)病個體逐漸增加，表現(xiàn)出一定的遲發(fā)特征。

三、家系致病基因

在rs10911021的位置有一個與青光眼候選基因重疊的連鎖峰，其LOD值為3.302，NPL值為16.67，位于染色體1q24.2～25.3(圖2)，該區(qū)域遺傳距離約14Mb，其中的MYOC為候選致病基因。然后，我們對該基因進行Sanger測序，在其MYOC G1099A鑒定出致病突變(G367R)(圖3)。

圖2 POAG家系致病基因的染色體定位

圖3 POAG家系MYOC G1099A突變的測序峰圖

四、致病基因的甲基化測序結果

患者、突變攜帶者及正常者，MYOC 上游0bp至-2000bp 啟動子區(qū)內(nèi)F1-R1 CG位點的檢測如熱圖所示(圖4)。3組甲基化豐度水平的改變，在疾病亞組之間無明顯差異。

圖4 疾病亞組之間Myoc甲基化聚類

討 論

POAG遺傳背景復雜，是多基因參與的高度遺傳異質(zhì)性疾病。迄今，通過家系的連鎖研究定義了29個青光眼遺傳位點，并鑒定了12個可能的青光眼致病基因[7]，其中包括MYOC[8]、OPTN[9]、CYP1B1[10]、WDR36[11]，ASB10和NTF4等等[12]。隨著基因組技術的發(fā)展，多個臨床研究中心通過基因組測序、外顯子測序、GWAS 、基因芯片等方法，對大量的青光眼家系及散發(fā)人群從POAG的內(nèi)在表型、線粒體、小梁網(wǎng)等相關基因進行檢測，又進一步發(fā)現(xiàn)了約50個可能青光眼遺傳位點[13]。但是由于POAG遺傳背景的復雜性，這些基因的發(fā)現(xiàn)僅解釋了不到10%POAG患者的發(fā)病原因[14]，在絕大多數(shù)POAG患者中這些變異都是罕見的。因此，繼續(xù)通過遺傳家系、大樣本及多中心研究進行致病基因的篩選、鑒定，敏感位點的定位和功能研究仍然是青光眼領域研究的熱點。

正是這些決定基因的存在，啟動一系列下游相關基因的級聯(lián)信號通路，誘導POAG的發(fā)生與發(fā)展。在本研究的家系中，患者攜帶相同致病基因，但發(fā)病年齡存在明顯差異，個體間發(fā)病年齡的時間跨度能達10余年之久，即存在疾病遲發(fā)現(xiàn)象。我們推測POAG遲發(fā)實質(zhì)上就是生物進化出來的對環(huán)境適應性的表觀響應機制。環(huán)境因素如飲食、肥胖、吸煙、日曬和年齡能引起基因組表觀層面的改變，例如DNA甲基化，組蛋白甲基化，組蛋白乙?；取ünemann 等研究發(fā)現(xiàn)青光眼患者的外周單核細胞中總的DNA甲基化水平比健康人存在明顯的升高[15]。Fiona等進一步利用ELISA方法檢測人青光眼小梁網(wǎng)細胞系和正常小梁網(wǎng)細胞系中總的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)人青光眼小梁網(wǎng)細胞系DNA甲基化水平高。低氧處理正常細胞系后，會出現(xiàn)與青光眼細胞系相似的甲基化與基因表達結果。說明低氧環(huán)境可以誘導DNA甲基化水平改變，從而使相關基因表達發(fā)生改變，進而誘發(fā)青光眼[16，17]。

本研究中我們初步應用全基因組甲基化測序檢測基因組上的差異甲基化區(qū)域，擬找到受不同環(huán)境因素刺激的個體間的表觀分子差異。但結果并不理想，考慮一代測序的局限性，測序開始的50個堿基可能存在序列的錯誤，以及樣本量偏少，可能存在偏差。因此，擴大樣本量檢查，重新調(diào)整檢測方法，或得到可觀的效果，而繼續(xù)行青光眼家系的遺傳研究，將有利于POAG復雜發(fā)病機制的闡明，而且對POAG預防、早期診斷和治療具有潛在的應用價值。