李曉紅 平美萱 王希振 王可 張達(dá)人 何芬 劉果 劉旭陽

青光眼是以眼內(nèi)壓(intraocular pressure, IOP)升高、視野缺損、視神經(jīng)萎縮為特征的一種致盲眼病。該病主要危險(xiǎn)因素為IOP升高，因此降低IOP是目前治療青光眼最有效的方法。前列腺素(prostaglandin, PG)F2α類藥物是目前最有效的局部降IOP藥物，主要有拉坦前列腺素、曲伏前列腺素和貝美前列腺素。曲伏前列腺素和拉坦前列腺素是PGF2α的酯前體，而貝美前列腺素是乙酰胺替代的PGF2α衍生物，有文獻(xiàn)將其歸為前列酰胺，但此種分類尚有爭(zhēng)議[1-4]。目前，在PGF2α類藥物治療青光眼的臨床實(shí)踐中，不同患者對(duì)于不同PGF2α類藥物的反應(yīng)在多方面表現(xiàn)出差異，包括副反應(yīng)和降IOP效果，出現(xiàn)了“同藥不同效”的情況[5-9]。

除了眼部副作用以外，PGF2α類藥物的全身副作用較少，但也有逐漸增多的病例報(bào)道。Rajan等報(bào)道了5例青光眼患者在使用拉坦前列腺素后出現(xiàn)了胸悶、胸部發(fā)緊的副作用[10]；Mitra報(bào)道了拉坦前列腺素引發(fā)心絞痛的病例[11];Lee報(bào)道了1例34歲女性患者在滴用曲伏前列腺素后出現(xiàn)腹部痙攣性疼痛[12]；George報(bào)道了3例使用PGF2α類藥物的患者均出現(xiàn)了胃腸道不良反應(yīng)[13]；余曼報(bào)道的1例女性患者在使用曲伏前列素和拉坦前列腺素之后均出現(xiàn)惡心、腹痛和腹瀉，換用貝美前列腺素后癥狀消失[8]；我們前期也報(bào)道了使用PGF2α類藥物出現(xiàn)胃腸道副作用的青光眼病例[14]。目前，PGF2α類藥物全身副作用的分子機(jī)理及其遺傳相關(guān)性尚不清楚，相關(guān)的研究也很少，這給PGF2α類藥物治療青光眼的臨床應(yīng)用帶來了挑戰(zhàn)。本研究報(bào)道3例滴用PGF2α類藥物后出現(xiàn)心血管副作用的臨床病例。我們從藥物作用機(jī)理出發(fā)，分析候選基因，初步探索患者基因序列與藥物副作用之間的關(guān)系，為PGF2α類藥物的精準(zhǔn)臨床應(yīng)用提供參考。

資料與方法

一、臨床檢查

該研究獲得暨南大學(xué)深圳眼科醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，遵從赫爾辛基宣言，在取得患者知情同意的情況下進(jìn)行。所有臨床檢查尊重并保證患者的知情權(quán)和自主權(quán)。

二、全血基因組DNA抽提

抽取患者靜脈血，用Qiamp Blood DNA mini Kit(Qiagen,德國(guó))抽提基因組DNA。

三、引物設(shè)計(jì)與合成

進(jìn)入NCBI網(wǎng)站，搜索候選基因序列，用軟件Primer Premier 6.0(Premier, 加拿大)設(shè)計(jì)引物，交由華大基因公司合成。引物合成后，用三羥甲基氨基甲烷-EDTA[Tris (hydroxymethyl) aminomethane-EDTA,TE]緩沖液稀釋至10 pmol/μl，用于聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增。

四、PCR擴(kuò)增

40 μl擴(kuò)增體系；20 μl 2×Taq Master Mix(E005-02A，novoprotein, 中國(guó))，16 μl無菌水，2 μl基因組DNA(30～40 ng)，1 μl正向引物，1 μl反向引物。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃變性30 s，51～62 ℃(引物退火溫度，部分見表1)退火30 s，72 ℃延伸(1 min/1 kb)，30循環(huán)；最后72 ℃終止延伸10 min，并將反應(yīng)產(chǎn)物保存于4 ℃。

表1 FP和STC1基因的部分?jǐn)U增引物

五、測(cè)序及序列比對(duì)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接送由華大基因進(jìn)行常規(guī)測(cè)序，用軟件Lasergene 11.0 (DNASTAR, 美國(guó)) 將患者序列和NCBI基因序列進(jìn)行比對(duì)，尋找患者序列的變異。

結(jié) 果

一、病例1;61歲女性。因“雙眼視力逐漸下降5年”于2018年5月21日入院(深圳眼科醫(yī)院)?；颊?年前因雙眼青光眼接受激光虹膜周邊切除術(shù)，術(shù)后長(zhǎng)期使用前列腺素類藥物控制IOP，門診規(guī)律復(fù)查。后來，患者覺得視力下降加重，停用降IOP藥物后測(cè)量24 h IOP，右眼14.7～23.0 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa), 左眼13.3～23.0 mmHg。入院時(shí)，患者否認(rèn)眼部外傷史，否認(rèn)高血壓、糖尿病、冠心病、乙肝等全身病史。(1)眼部檢查：雙眼裸眼視力(uncorrected visual acuity, UCVA)0.7，矯正無助；中央前房軸深2 CT，周邊前房1/4 CT，晶體渾濁，眼底見雙眼視盤界清，色淡紅，杯盤比右眼約0.7、左眼約0.6。(2)眼科輔助檢查：非接觸式IOP計(jì)(noncontact tonometer, NCT)測(cè)IOP：右眼15.1 mmHg，左眼14.8 mmHg。中央角膜厚度(central corneal thickness, CCT)：右眼526 μm，左眼522 μm。超聲生物顯微鏡(ultrasound biomicroscopy, UBM)：右眼前房軸深1.67 mm，左眼前房軸深1.74 mm，雙眼周邊虹膜明顯膨隆，12，3，6，9點(diǎn)位房角明顯狹窄；提示雙眼淺前房，房角重度狹窄。Humphrey視野：右眼視野大致正常，左眼視野生理盲點(diǎn)擴(kuò)大。全身生命體征：體溫36.3 ℃，脈搏70次/分，呼吸頻率20次/分，血壓122/83 mmHg。住院時(shí)心電圖經(jīng)我院內(nèi)科醫(yī)生會(huì)診：大致正常，可以進(jìn)行超聲乳化晶狀體摘除與人工晶狀體植入聯(lián)合房角分離術(shù)。術(shù)后門診予以滴用拉坦前列腺素(瑞達(dá)喜、韓國(guó)生產(chǎn))，出現(xiàn)胸痛、頭暈，停藥后緩解。

基因測(cè)序結(jié)果;為了分析該病例滴用拉坦前列腺素后出現(xiàn)胸痛、頭暈癥狀的原因，探究其遺傳相關(guān)性，我們對(duì)已經(jīng)被報(bào)導(dǎo)與PGF2α類藥物降IOP作用機(jī)制相關(guān)的蛋白質(zhì)基因以及原發(fā)性開角型青光眼(primary open angle glaucoma, POAG)相關(guān)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序，尋找變異位點(diǎn)。我們沒有在病例1中發(fā)現(xiàn)POAG相關(guān)基因TIGR/myocilin和cytochrome P450 1B1 (CYP1B1)在外顯子和啟動(dòng)子區(qū)的序列變異。

PGF2α類藥物的降IOP作用由PGF2α受體(prostaglandin F receptor，F(xiàn)P)介導(dǎo)。FP基因啟動(dòng)子和1號(hào)內(nèi)含子上的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)位點(diǎn)rs3753380和rs3766355被認(rèn)為與拉坦前列腺素的降IOP效果相關(guān)[15]。我們發(fā)現(xiàn)，該病例FP編碼序列沒有變異。與使用PGF2α類藥物無全身系統(tǒng)性副作用的POAG患者(陰性對(duì)照)不同，該病例SNP位點(diǎn)rs3753380處為低頻率堿基T純合(圖1A, 1B)，rs3766355處為低頻率堿基C純合(圖2A, 2B)。除此之外，F(xiàn)P 3’-非翻譯區(qū)(untranslated region, UTR)的SNP 位點(diǎn)rs12731181被報(bào)道位于微小RNA(microRNA, miRNA) miR-590-3p的結(jié)合位點(diǎn)處，其變異會(huì)改變miR-590-3p與FP mRNA 3’-UTR的結(jié)合能力，從而改變FP的表達(dá)水平[16]。我們發(fā)現(xiàn)，該病例rs12731181處為高頻率堿基A純合(圖3B)，能和相應(yīng)抑制性miRNA miR-590-3p結(jié)合，從而維持其相對(duì)穩(wěn)定的低水平。

圖1 FP基因rs3753380的基因型(箭頭指示)A:對(duì)照(使用PGF2α類藥物無全身系統(tǒng)性副作用的POAG患者)；B:病例1；C:病例2；D:病例3

圖2 FP基因rs3766355的基因型(箭頭指示)A:對(duì)照(使用PGF2α類藥物無全身系統(tǒng)性副作用的POAG患者)；B:病例1；C:病例2；D:病例3

據(jù)報(bào)道，拉坦前列腺素的降IOP機(jī)制是斯鈣素1(stanniocalcin 1，STC1)依賴的，拉坦前列腺素會(huì)誘導(dǎo)STC1的表達(dá)[17]，而STC1會(huì)通過調(diào)節(jié)孤束核神經(jīng)元鈣平衡而抑制動(dòng)脈壓和心率，導(dǎo)致低血壓和心動(dòng)過緩[18]。因此，我們也對(duì)STC1進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和序列分析。我們發(fā)現(xiàn)，該病例STC1基因的編碼序列無突變。基因243位(5’- UTR)雜合缺失A(雜合c.243 delA, 圖4B)，使該位點(diǎn)單堿基A的串聯(lián)重復(fù)次數(shù)由12變?yōu)?1，但此變異在陰性對(duì)照(使用PGF2α類藥物無全身系統(tǒng)性副作用的POAG患者)上亦存在(圖4A)。

圖3 FP基因rs12731181的基因型(箭頭指示)A:對(duì)照(使用PGF2α類藥物無全身系統(tǒng)性副作用的POAG患者)；B:病例1；C:病例2；D:病例3

圖4 STC1基因單鏈缺失A(箭頭指示)A:對(duì)照(使用PGF2α類藥物無全身系統(tǒng)性副作用的POAG患者)；B:病例1；C:病例2；D:病例3。測(cè)序峰圖為反向測(cè)序序列的反向互補(bǔ)

二、病例2;42歲，女性。因“雙眼抗青光眼術(shù)后3年，IOP控制不佳1年，加重1周”于2016年11月28日入院?；颊?年前因雙眼青光眼在外院行復(fù)合小梁切除術(shù)，1年前常規(guī)復(fù)診發(fā)現(xiàn)IOP控制不佳，入院前1周IOP明顯升高。入院時(shí)患者否認(rèn)眼部外傷史，否認(rèn)高血壓、糖尿病、冠心病、乙肝等全身病史。眼部檢查;右眼UCVA0.8，矯正視力(best corrected visual acuity, BCVA)1.0；左眼UCVA 0.8，BCVA 1.0。雙眼結(jié)膜上方濾過泡低平，血管長(zhǎng)入。眼底見雙眼視盤界清，色淡紅，杯盤比右眼約0.7、左眼約0.4。眼科輔助檢查;Goldmann壓平IOP;雙眼28 mmHg；CCT;右眼526 μm，左眼522 μm。UBM;右眼前房軸深3.3 mm，左眼前房軸深3.38 mm，雙眼 12，3，6，9點(diǎn)位房角開放。Humphrey視野;雙眼殘余中心及顳側(cè)視島。相干光層析成像術(shù)(optical coherence tomography, OCT);雙眼視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層(retinal nerve fiber layer, RNFL)廣泛變薄。全身生命體征;體溫36.2 ℃，脈搏54次/分，呼吸頻率20次/分，血壓120/70 mmHg。出院后門診復(fù)查時(shí)自訴使用拉坦前列腺素時(shí)出現(xiàn)心慌、心跳加速，自行停藥后緩解。后改用阿法根、蘇為坦后再未出現(xiàn)上述癥狀。

基因測(cè)序結(jié)果;我們沒有在病例2中發(fā)現(xiàn)POAG相關(guān)基因TIGR/myocilin和CYP1B1在外顯子和啟動(dòng)子區(qū)的序列變異。該病例FP基因的編碼序列也沒有變異。與使用PGF2α類藥物無全身系統(tǒng)性副作用的POAG患者(陰性對(duì)照)不同，該病例SNP位點(diǎn)rs3753380處為低頻率堿基T純合(圖1A, 1C)，rs3766355處為低頻率堿基C純合(圖2A, 2C)。3’- UTR的SNP 位點(diǎn)rs12731181處為高頻率堿基A(圖3C)，能和相應(yīng)抑制性miRNA miR-590-3p結(jié)合，從而維持其相對(duì)穩(wěn)定的低水平。

該病例STC1基因的編碼序列無突變?；?’- UTR存在雜合c.243 delA(圖4C)，使該位點(diǎn)單堿基A的串聯(lián)重復(fù)次數(shù)由12變?yōu)?1；基因63位(5’-UTR) SNP位點(diǎn)rs1438452處為T / C雜合(圖5A)，T>C變異擴(kuò)展了該位點(diǎn)微衛(wèi)星DNA CGG重復(fù)次數(shù)；147位(5’-UTR) SNP位點(diǎn) rs1438453處為A/C雜合(圖5B), A>C變異同樣擴(kuò)展了CAA重復(fù)次數(shù)，導(dǎo)致了CAA重復(fù)形成的微衛(wèi)星DNA的不穩(wěn)定。

圖5 病例2 STC1基因5’- UTR基因型(箭頭指示)A:rs1438452 為T/C雜合；B:rs1438453為A/C雜合

三、病例3;57歲，女性。因“發(fā)現(xiàn)雙眼IOP升高6年，偶有眼脹”于2014年11月25日就診于我院門診，未使用降IOP藥物，規(guī)律復(fù)查。患者否認(rèn)眼部外傷史，否認(rèn)高血壓、糖尿病、冠心病、乙肝等全身病史。眼部檢查;右眼UCVA 1.0，BCVA1.0；左眼UCVA 0.4，BCVA 0.8。雙眼杯盤比約0.7。眼科輔助檢查;NCT;右眼20.4 mmHg，左眼20.0 mmHg。CCT;右眼566 μm，左眼544 μm。OCT;右眼RNFL可疑偏薄。Humphrey視野;右眼局部視敏度下降?；颊哂?016年1月19日復(fù)查發(fā)現(xiàn)右眼杯盤比約0.8，較前進(jìn)展。眼科輔助檢查;日多次Goldmann壓平IOP:右眼最高24 mmHg，左眼最高20 mmHg。OCT;右眼視盤下方RNFL變薄。Humphrey視野;右眼鼻上方弧形暗點(diǎn)。囑患者使用阿法根(酒石酸溴莫尼定)右眼一日2次，后于2016年2月23日予以瑞達(dá)喜(拉坦前列腺素)右眼每晚1次，均未訴不適。再于2016年3月25日復(fù)診：將瑞達(dá)喜換為盧美根(貝美前列腺素)右眼每晚1次。2016年5月20日再次復(fù)診時(shí)訴;使用盧美根后有明顯的心慌、頭暈癥狀，未至綜合醫(yī)院心內(nèi)科就診。囑患者停用盧美根繼續(xù)使用瑞達(dá)喜，后又使用過蘇為坦均未出現(xiàn)心慌、頭暈等癥狀。

基因測(cè)序結(jié)果;該病例POAG相關(guān)基因TIGR/myocilin和CYP1B1亦沒有發(fā)現(xiàn)序列變異。FP基因編碼序列沒有突變，SNP位點(diǎn)rs3753380，rs3766355和rs12731181處為各自的高頻率堿基C, A, A的純合型(圖1D, 2D和3D)。該病例的STC1基因，除了5’- UTR存在雜合c.243 delA(圖4D)以外，其余序列無變異。

討 論

本研究我們報(bào)道了3例特殊的女性POAG 病例，她們?cè)谑褂肞GF2α類藥物后出現(xiàn)了類似的心血管系統(tǒng)副作用。病例1和2均是在使用拉坦前列腺素后出現(xiàn)了心血管副作用，其中病例1出現(xiàn)了胸痛、頭暈，病例2出現(xiàn)了心慌、心跳加速。病例3則是用貝美前列腺素治療后出現(xiàn)了明顯的心慌和頭暈癥狀。病例1出現(xiàn)胸痛的原因可能是因?yàn)樾募∪毖?。有研究認(rèn)為前列腺素類藥物會(huì)導(dǎo)致低血壓和心動(dòng)過緩[19]，因此病例1、3出現(xiàn)頭暈的癥狀可能是因?yàn)镻GF2α類藥物引起血壓降低，大腦供血不足導(dǎo)致。病例2、3都出現(xiàn)了心慌的癥狀。一般，心率過快、過慢以及有過早搏動(dòng)時(shí)都會(huì)產(chǎn)生心慌的感覺。由于病例2明確說明自己心動(dòng)過速，與PGF2α類藥物會(huì)導(dǎo)致心動(dòng)過緩的說法似乎矛盾，但PGF2α類藥物引起的血壓降低會(huì)刺激主動(dòng)脈弓和頸動(dòng)脈竇上的壓力感受器，從而引起反射性心率增高，當(dāng)此反射起主要作用時(shí)患者表現(xiàn)為心動(dòng)過速。

研究證明，拉坦前列腺素和曲伏前列腺素進(jìn)入睫狀體后是通過選擇性激活FP，引起基質(zhì)金屬蛋白酶釋放[20,21]，降解睫狀肌胞外介質(zhì), 增加房水經(jīng)葡萄膜鞏膜通道外流而降低IOP。貝美前列腺素降IOP的作用機(jī)理目前尚有爭(zhēng)議。有研究認(rèn)為貝美前列腺素同屬PGF2α類似物，通過激活FP而發(fā)揮作用[22-24]；另有研究認(rèn)為貝美前列腺素是一種前列酰胺類似物，通過激活一種前列酰胺受體或新的FP剪接體而發(fā)揮作用[3,25,26]。由于存在貝美前列腺素可以治療拉坦前列腺素不敏感病人[7,9]、使用拉坦前列腺素有胃腸道副作用的病人使用貝美前列腺素卻沒有[8]、以及FP受體敲除小鼠對(duì)貝美前列腺素喪失敏感性[22]等現(xiàn)象，貝美前列腺素也會(huì)激活FP或新的FP剪接體，但由于其結(jié)構(gòu)具有與拉坦前列腺素和曲伏前列腺素之間的差異性，貝美前列腺素對(duì)FP或新的FP剪接體的選擇專一性可能不同于拉坦前列腺素和曲伏前列腺素[14,27]。此外，由于各前列腺素受體之間的同源性高，PGF2α類藥物對(duì)各種前列腺素受體的選擇性并不高。有研究表明，拉坦前列腺素除了對(duì)FP具有相對(duì)很高的親和力外，對(duì)前列腺素E受體1型(prostaglandin E receptor 1, EP1)也表現(xiàn)出親和力。同樣，貝美前列腺素游離酸除了對(duì)FP表現(xiàn)出較高的親和力以外，還可與EP1 和EP3結(jié)合[2,28]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，個(gè)別病例表現(xiàn)出的對(duì)拉坦前列腺素和貝美前列腺素的不同臨床反應(yīng)，以及極少數(shù)病例中出現(xiàn)的胃腸道副作用，可能與其前列腺素類受體的基因型有關(guān)[14,27]。

文獻(xiàn)報(bào)道指出，F(xiàn)P上兩個(gè)SNP位點(diǎn)(啟動(dòng)子區(qū)rs3753380和內(nèi)含子1上rs3766355)的基因型會(huì)直接影響受體的表達(dá)水平。如果rs3753380為T，rs3766355為C，F(xiàn)P的表達(dá)水平將會(huì)降低[15]。我們發(fā)現(xiàn)病例1和2的FP基因編碼序列均沒有突變，但rs3753380處均為T，rs3766355處均為C，提示兩者的FP表達(dá)水平均相對(duì)較低。不僅如此，病例1和2的FP基因3’-UTR區(qū)rs12731181均為A，該基因型轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA能和相應(yīng)抑制性miRNA miR-590-3p結(jié)合，進(jìn)一步阻礙了FP的表達(dá)。我們推測(cè)，由于患者FP水平低，拉坦前列腺素可能更多地由EP1來介導(dǎo)。EP1的過度激活會(huì)導(dǎo)致低血壓而引發(fā)一些類似心臟供血不足的癥狀[19,29]，如頭暈。低血壓也可刺激壓力感受器引起反射性心率增高，出現(xiàn)心動(dòng)過速。心動(dòng)過速和冠脈收縮引起的心肌缺血?jiǎng)t可能進(jìn)一步引發(fā)胸痛。與病例1和2不同，我們沒有發(fā)現(xiàn)病例3 FP基因序列的變異及SNP rs3753380和rs3766355處低頻率堿基的出現(xiàn)，提示貝美前列腺素心血管系統(tǒng)副作用的機(jī)制還在FP之外，需要更深入的研究。

STC1介導(dǎo)了拉坦前列腺素的降IOP機(jī)制，拉坦前列腺素會(huì)誘導(dǎo)其表達(dá)[17]。除了降IOP, STC1還會(huì)通過調(diào)節(jié)孤束核神經(jīng)元的鈣平衡而抑制動(dòng)脈壓和心率，導(dǎo)致低血壓和心動(dòng)過緩[18]。我們發(fā)現(xiàn)，3個(gè)病例STC1基因的編碼序列均無突變，但均存在雜合c.243 delA，使5’- UTR區(qū)該位點(diǎn)單堿基A的重復(fù)次數(shù)由12減少為11。由于此變異在陰性對(duì)照(使用PGF2α類藥物無全身系統(tǒng)性副作用的POAG患者)上亦存在，所以該變異應(yīng)該不是一個(gè)與PGF2α類藥物心血管副作用直接相關(guān)的獨(dú)立因素，但不排除該因素合并FP變異會(huì)增加PGF2α類藥物心血管副作用發(fā)生的可能。除此之外，病例2 STC1基因的5’-UTR SNP位點(diǎn)rs1438452(63位)為雜合T/C，C擴(kuò)展了該位點(diǎn)所在CAG/CGG微衛(wèi)星DNA區(qū)域CGG的重復(fù)次數(shù)，同時(shí)147位(5’-UTR) SNP位點(diǎn) rs1438453 為A/C雜合，C同樣擴(kuò)展了該位點(diǎn)所在微衛(wèi)星DNA CAA的重復(fù)次數(shù)。我們推測(cè)，5’- UTR區(qū)CAA/CAG/CGG重復(fù)次數(shù)的擴(kuò)展很可能通過改變STC1翻譯過程中核糖體的掃描而影響STC1的表達(dá)，從而影響STC1基因?qū)GF2α類藥物的反應(yīng)，抑制動(dòng)脈壓和心率，最終導(dǎo)致低血壓和心動(dòng)過緩。

綜上所述，PGF2α類藥物臨床應(yīng)用可能發(fā)生的全身系統(tǒng)副作用與其降IOP機(jī)制相關(guān)，機(jī)制相關(guān)蛋白的基因變異可增加患者產(chǎn)生系統(tǒng)副作用的概率。PGF2α類藥物受體FP及其下游蛋白STC1基因的變異可能導(dǎo)致患者在使用PGF2α類藥物時(shí)產(chǎn)生較為嚴(yán)重的心血管系統(tǒng)副作用。但由于受病例數(shù)的限制，本論文的研究結(jié)果還需進(jìn)一步驗(yàn)證。為了減少藥物副作用的發(fā)生，臨床醫(yī)生需要更多關(guān)注臨床用藥，關(guān)注患者基因背景，以實(shí)現(xiàn)臨床精準(zhǔn)用藥，提高治療效果。