萬(wàn)騰飛，呂 彥，劉 亮△

(北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院：1.干一科；2.神經(jīng)內(nèi)科，沈陽(yáng) 110016)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種起病隱匿、進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶和認(rèn)知功能障礙及神經(jīng)精神癥狀[1]。AD早期的病理改變主要表現(xiàn)為淀粉樣蛋白的沉積(β-amyloid，Aβ)、神經(jīng)纖維纏結(jié)和突觸的丟失。既往研究表明，通過(guò)促進(jìn)AD小鼠的突觸形成可有效改善認(rèn)知功能[2]。而成對(duì)免疫球蛋白樣受體B(paired-immunoglobulin-like receptor B，PirB)能作為Aβ的受體，使絲切蛋白去磷酸化并活化，導(dǎo)致突觸的丟失和可塑性的降低[3]。肝X 受體(liver X receptor，LXR)包括 LXRα和 LXRβ兩型，屬于配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，研究表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的內(nèi)源性LXRβ活化能夠有效調(diào)節(jié)脂代謝、神經(jīng)炎癥及突觸可塑性[4]。然而，LXRβ能否通過(guò)PirB調(diào)節(jié)海馬突觸可塑性來(lái)改善AD小鼠的認(rèn)知功能障礙目前尚缺乏報(bào)道。本研究采用經(jīng)典的APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠，通過(guò)給予LXRβ激動(dòng)劑，檢測(cè)對(duì)APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改善作用，并探討LXRβ對(duì)PirB的影響和對(duì)海馬組織突觸形成的調(diào)節(jié)作用與機(jī)制，旨在為治療AD引起的學(xué)習(xí)認(rèn)知障礙提供治療靶點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑

LXRβ激動(dòng)劑T0901317(美國(guó)Sigma公司)、PirB抗體(美國(guó)R&D公司)、β-actin抗體(英國(guó)Abcam公司)、Synapsin抗體(英國(guó)Abcam公司)、PSD-95抗體(英國(guó)Abcam公司)、生物素二抗(美國(guó)Life Technologies公司)等。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

20只APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠及10只同窩野生(wild-type，WT)小鼠購(gòu)于南京模式動(dòng)物中心，9個(gè)月齡，雄性，所有實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)在溫度與濕度適宜的潔凈環(huán)境中，自由攝食，分籠飼養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理及保護(hù)的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組與藥物處理

WT小鼠作為對(duì)照組(WT組，n=10)，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠分為AD組(AD組，n=10)和T0901317處理組(AD+T0組，n=10)。其中AD+T0組小鼠采用灌胃給予50 mg/kg的T0901317，連續(xù)處理14 d，WT組和AD組給予同等劑量的二甲基亞砜(DMSO)溶劑。

1.2.2新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[5]的方法，對(duì)小鼠進(jìn)行新物體識(shí)別行為學(xué)檢測(cè)。具體操作如下：先將兩個(gè)完全相同的圓柱形物體(A物體)分別放在測(cè)試箱的兩側(cè)，放入小鼠讓其在箱內(nèi)適應(yīng)3 min，再讓小鼠休息15 min，進(jìn)行測(cè)試階段，將一側(cè)的圓柱形物體換為立方體盒(B物體)，立方體盒底面邊長(zhǎng)與之前的圓柱體盒直徑一樣，然后將待測(cè)試小鼠放入測(cè)試箱中，讓其自由探索3 min，采用Ethovision XT軟件記錄并分析小鼠探索新物體及舊物體的時(shí)間，即鼻尖距離物體邊緣小于2 cm，探索偏愛(ài)指數(shù)=小鼠探索新物體的時(shí)間(B)/小鼠探索所有物體的總時(shí)間(A+B)×100%。

1.2.3水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[6]的方法，對(duì)小鼠進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)。具體操作如下：在正式進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè)的前1 d，將所有小鼠進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練，消除不同實(shí)驗(yàn)組小鼠對(duì)各個(gè)象限的探索偏愛(ài)。接著對(duì)所有小鼠進(jìn)行4 d正式的實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練，將小鼠放入水中，讓小鼠游泳找到隱藏的平臺(tái)，總共限時(shí)60 s，若在60 s以內(nèi)未能找到平臺(tái)，則將小鼠放到平臺(tái)上，小鼠每次在平臺(tái)上停留20 s，記錄小鼠每次找到平臺(tái)的潛伏期。第5天將平臺(tái)撤去，檢測(cè)小鼠對(duì)平臺(tái)象限的記憶水平。每次試驗(yàn)進(jìn)行60 s，記錄小鼠找到正確象限的潛伏期，并記錄小鼠在60 s內(nèi)進(jìn)入正確象限的總次數(shù)。

1.2.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)

小鼠行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，對(duì)小鼠進(jìn)行灌注，取材，將腦組織利用4%及30%蔗糖溶液進(jìn)行脫水固定后，進(jìn)行冰凍切片。用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)小鼠腦切片進(jìn)行漂洗，加入一抗兔抗-離子鈣結(jié)合銜接分子-1(Iba-1)，放入4 ℃冰箱中孵育12 h，再用0.01 mol/L PBS進(jìn)行漂洗后，加入生物素二抗，在37 ℃孵箱中反應(yīng)3 h，再用0.01 mol/L PBS進(jìn)行漂洗，加入SABC溶液放入到37 ℃孵箱中反應(yīng)1 h，漂洗后采用DAB溶液進(jìn)行顯色，貼片，采圖。統(tǒng)計(jì)海馬組織中Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算出Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的密度，每組共采用4個(gè)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，以此反映小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量。

1.2.5Western blot檢測(cè)

取材后，將小鼠腦組織置于冰上分離出海馬組織，加入組織裂解液，用組織破碎機(jī)對(duì)海馬組織進(jìn)行研磨，離心后取上清液。利用BCA試劑盒對(duì)各標(biāo)本的蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。按照說(shuō)明書(shū)上的流程配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳凝膠，加入蛋白樣品進(jìn)行電泳，接著采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用5%的脫脂奶粉溶液對(duì)PVDF膜進(jìn)行封閉3 h，漂洗后分別加入對(duì)應(yīng)的抗體，在4 ℃條件下孵育12 h，采用TBST清洗后，分別加入對(duì)應(yīng)的二抗，在37 ℃條件下反應(yīng)2 h，漂洗后加入發(fā)光液，用Bio-Rad ChemiDoc MP多功能成像系統(tǒng)顯影采圖。最后利用ImageJ軟件對(duì)各條帶上的灰度值進(jìn)行分析，并以β-actin為內(nèi)參計(jì)算出成對(duì)免疫球蛋白樣受體B(PirB)、海馬突觸相關(guān)蛋白Synapsin和PSD-95相對(duì)表達(dá)水平。并以WT組為參考，分別算出各組目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，每組共采用4個(gè)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 T0901317對(duì)AD小鼠認(rèn)知功能的影響

新物體識(shí)別行為學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AD組存在短時(shí)記憶的障礙，表現(xiàn)為對(duì)新物體的探索偏愛(ài)指數(shù)明顯低于WT組，而AD+T0組對(duì)新物體的探索偏愛(ài)指數(shù)明顯提升(P<0.05)。Morris水迷宮行為學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在第5天測(cè)試階段，AD組在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比明顯低于WT組(P<0.05)，AD組同時(shí)進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù)也明顯低于WT組(P<0.05)。而AD+T0組在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比及進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù)明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

A：小鼠進(jìn)行新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)對(duì)新物體的探索偏愛(ài)指數(shù)；B：Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中小鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間所占的百分比；C：Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中各組小鼠進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù);a：P<0.05，與WT組比較；b：P<0.05，與AD+T0組比較。

2.2 T0901317對(duì)AD小鼠海馬組織Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響

免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AD組海馬組織Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比WT組多(P<0.05)，而AD+T0組海馬組織Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

A:WT組小鼠海馬組織Iba-1免疫組織化學(xué)染色圖；B：AD組小鼠海馬組織Iba-1免疫組織化學(xué)染色圖；C:AD+T0組小鼠海馬組織Iba-1免疫組織化學(xué)染色圖；D：3組小鼠海馬組織Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞密度統(tǒng)計(jì)圖;a：P<0.05，與WT組比較；b：P<0.05，與AD+T0組比較。

2.3 T0901317對(duì)AD小鼠海馬組織PirB、Synapsin和PSD-95表達(dá)水平的影響

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與WT組比較，AD組海馬組織PirB表達(dá)水平升高，Synapsin和PSD-95表達(dá)水平降低(P<0.05)，而AD+T0組PirB表達(dá)水平降低，Synapsin和PSD-95表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

A：Western blot檢測(cè)；B：小鼠海馬組織PirB半定量分析 C:小鼠海馬組織Synapsin半定量分析；D:小鼠海馬組織PSD-95半定量分析,a：P<0.05，與WT組比較；b：P<0.05，與AD+T0組比較。

3 討 論

AD是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD患者最早表現(xiàn)出的臨床癥狀為海馬相關(guān)的記憶丟失，是突觸功能異常的結(jié)果。使用功能磁共振成像(fMRI)在體腦成像技術(shù)，發(fā)現(xiàn)與記憶相關(guān)的腦區(qū)往往形成異常的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系[7]。采用電子顯微鏡進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)AD患者海馬區(qū)域突觸丟失明顯，且這種突觸丟失的嚴(yán)重程度與記憶減退的程度明顯相關(guān)[8]。BERTONI-FREDDARI等[9]證實(shí)AD小鼠海馬組織平均單個(gè)神經(jīng)元的突觸數(shù)較非AD對(duì)照組減少50%。AD患者腦組織內(nèi)突觸相關(guān)蛋白(Synapsin和PSD-95)的丟失與AD患者認(rèn)知功能減退的程度密切相關(guān)[10]。采用免疫組織化學(xué)與免疫印跡分析表明AD患者腦組織中突觸前蛋白與突觸后蛋白較同齡非AD對(duì)照組明顯降低，亦提示這些特異的突觸蛋白參與AD病的進(jìn)程[11]。同樣，在AD動(dòng)物模型中觀察到AD早期的病理改變主要表現(xiàn)為淀粉樣蛋白的沉積和突觸的丟失。此外，通過(guò)將胚胎干細(xì)胞來(lái)源的神經(jīng)前體細(xì)胞移植入AD模型大鼠內(nèi)能分化為神經(jīng)元并與靶區(qū)神經(jīng)元建立了突觸，并檢測(cè)到學(xué)習(xí)記憶得到改善[12]。因此，對(duì)AD中突觸功能調(diào)控機(jī)制研究為AD治療提供重要途徑。本研究結(jié)果提示，LXRβ激動(dòng)劑T0901317可以通過(guò)調(diào)節(jié)AD小鼠海馬組織的突觸可塑性來(lái)改善認(rèn)知功能。

LXR包括 LXRα和 LXRβ兩型，屬于配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子。其中LXRα主要分布在與脂代謝相關(guān)的組織與細(xì)胞如肝臟、小腸、脂肪組織等，LXRβ在體內(nèi)有更廣泛的表達(dá)。研究資料顯示LXR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中亦有重要功能，其中LXRβ為主要的亞型表達(dá)受體。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中內(nèi)源性LXRβ活化能夠有效調(diào)節(jié)脂代謝與炎性反應(yīng)[13]。當(dāng)腦組織的炎癥使疾病加重時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)過(guò)多活化產(chǎn)生嚴(yán)重的神經(jīng)毒性[14]。已有研究表明，LXRβ能通過(guò)核因子-κB(NF-κB)通路來(lái)減少AD小鼠中的星形膠質(zhì)細(xì)胞形成，從而防止膽堿能神經(jīng)元被損傷[15]。同時(shí)，LXRβ能夠促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)腦內(nèi)的Aβ蛋白的清除[16]。在本研究中，也進(jìn)一步證實(shí)了，LXRβ激動(dòng)劑T0901317可以明顯降低AD小鼠海馬組織的Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，從而抑制腦內(nèi)的過(guò)度炎性反應(yīng)。

PirB是存在于小鼠體內(nèi)和人類白細(xì)胞免疫球樣蛋白受體B2(human leukocyte immunoglobulin-like receptor B2，LILRB2)同源的一類膜蛋白受體。起初發(fā)現(xiàn)，在免疫系統(tǒng)中PirB在B淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞中表達(dá)，能作為主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(MHCⅠ)的受體來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[17]。近期研究發(fā)現(xiàn)，PirB表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，PirB的表達(dá)水平增高，且能通過(guò)和軸突抑制生長(zhǎng)因子Nogo、OMgp和MAG的相互作用來(lái)抑制軸突的生長(zhǎng)和神經(jīng)元的可塑性[18-19]。此外，PirB的突變鼠，在視神經(jīng)損傷后對(duì)比對(duì)照組，表現(xiàn)出極強(qiáng)的視皮層的可塑性[20]。最新研究發(fā)現(xiàn)，在AD小鼠中，PirB能作為Aβ的受體，使蛋白磷酸酶PP2A和PP2B上調(diào)，從而使絲切蛋白去磷酸化并活化，活化的絲切蛋白使肌動(dòng)蛋白絲解聚，最終導(dǎo)致突觸的丟失和可塑性的丟失[3]。本研究也進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，通過(guò)活化內(nèi)源的LXRβ可以降低AD小鼠海馬組織PirB的表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而改善AD小鼠的認(rèn)知功能，提示LXRβ可能通過(guò)PirB調(diào)節(jié)AD小鼠海馬的突觸可塑性，進(jìn)而改善記憶和認(rèn)知功能障礙。

綜上所述，本研究證實(shí)了LXRβ激動(dòng)劑激活內(nèi)源性LXRβ會(huì)對(duì)AD所致的突觸損傷有一定的修復(fù)作用,并能改善AD小鼠的記憶和認(rèn)知功能障礙。該研究可為治療AD提供新的靶點(diǎn)，并提供干預(yù)的措施以緩解AD引起的記憶和認(rèn)知功能障礙，為臨床治療AD患者提供新的藥物可能。