鄧穗燕，郭旭光，李 瑩，夏 勇△

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院檢驗科，廣州 510150；2.廣東省清遠市清城區(qū)人民醫(yī)院檢驗科 511500)

臨床微生物實驗室主要依靠手工接種的方法進行標本前處理，手工方法的局限性在于因檢驗人員技術(shù)水平難以統(tǒng)一，標本處理很難實現(xiàn)標準化操作，不利于尿培養(yǎng)的后續(xù)實驗及結(jié)果解釋。臨床微生物檢驗最大的制約因素還是在質(zhì)量控制和標準化方面。在國內(nèi)，最早在2006年被引入使用的是意大利Diesse公司的Robobact自動接種培養(yǎng)系統(tǒng)，僅有3家醫(yī)院相繼使用并報道了儀器的性能[1-3]。直到近幾年，全自動微生物標本處理系統(tǒng)以其工作高效性在國內(nèi)迅速受到關(guān)注[4-7]。目前，全球微生物流水線系統(tǒng)只有美國BD公司和意大利Copan公司提供，梅里埃公司只有1臺Isola單機版的自動化接種儀，且其已經(jīng)正式宣布退出在臨床微生物自動化流水線設(shè)備上的研發(fā)和投入。2015年，BD Kiestra InoqulA作為在中國的第1臺全自動標本處理系統(tǒng)在廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院實驗室投入使用，國內(nèi)尚未有關(guān)于BD Kiestra InoqulA應(yīng)用的報道。為此，本研究通過觀察儀器接種分離到的單個菌落數(shù)、菌種數(shù)、總的菌落計數(shù)和陽性率，并與手工方法比對，進而對BD Kiestra InoqulA性能進行評價，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年10-11月廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院各臨床科室送檢的“中段尿培養(yǎng)、菌落計數(shù)”標本810例和“需氧+厭氧培養(yǎng)”的血/無菌體液陽性標本120例(瓶)。所有標本按照本實驗室標本采集手冊要求留取。

1.2 方法

1.2.1儀器與試劑

BD Kiestra InoqulA全自動標本處理系統(tǒng)、BACTEC FX血培養(yǎng)儀、比濁儀(美國BD公司)，MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀(德國Bruker公司)，CO2培養(yǎng)箱(香港立康)，加樣槍(德國Eppendorf公司)；真空含防腐劑尿管、血培養(yǎng)瓶(美國BD公司)，一次性10 μL定量接種環(huán)(英國MWE公司)，9 cm血瓊脂平板(江門凱林貿(mào)易有限公司)；α-氰基-4羥基肉桂酸(HCCA，美國Sigma-Aldrich公司)，接種培養(yǎng)液(美國BD公司)。

1.2.2質(zhì)控菌株

大腸埃希菌ATCC25922(隨廣東省臨床檢驗中心室間質(zhì)評標本附送)。

1.2.3尿標本接種

將當天送檢的尿標本先上機接種(Z字劃線)，再進行手工接種。手工接種：將尿標本顛倒混勻，開蓋，用10 μL定量接種環(huán)垂直浸入尿液標本表面下3～5 mm，將標本吸至環(huán)中；在血瓊脂平板上劃十字，再進行密集均勻涂布。

1.2.4血/無菌體液培養(yǎng)陽性標本接種

75%乙醇消毒陽性培養(yǎng)瓶瓶口，顛倒培養(yǎng)瓶混勻菌液，用2 mL無菌注射器抽取2 mL菌液打入BD真空尿管里，先上機接種(四區(qū)劃線)，再進行手工接種。手工接種：吸取標本方法同尿接種，在血瓊脂平板第一區(qū)密集均勻涂布，四區(qū)劃線。

1.2.5培養(yǎng)及結(jié)果觀察

標本接種后，把血瓊脂平板放入5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，如遇菌落生長不良的標本培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長情況。930例標本皆進行儀器和手工接種比對，記錄平板上可計數(shù)的單個菌落數(shù)、菌落總數(shù)(換算為cfu/mL)和菌種數(shù)。

1.2.6MALDI-TOF MS菌種鑒定

對懷疑兩種或以上菌落生長的標本，作質(zhì)譜鑒定，以確認菌種數(shù)。用牙簽挑取單個菌落，均勻點涂到靶板上；吸取1 μL 70%甲酸涂敷到標本上；吸取1 μL HCCA基質(zhì)液涂敷到標本上，待干燥后上機。

1.2.7質(zhì)量控制及交叉污染試驗

將ATCC25922用接種培養(yǎng)液制備0.5麥氏濁度的細菌混懸液，用加樣槍吸取10 μL加到BD真空尿管里，再加2 mL接種培養(yǎng)液稀釋200倍作為陽性質(zhì)控，放置在儀器標本架的1號位；用無菌注射器抽取2 mL接種培養(yǎng)液打入BD真空尿管里，制作9管，作為陰性質(zhì)控，放置在儀器標本架的2～10號位。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)控及交叉污染試驗結(jié)果

陽性質(zhì)控經(jīng)儀器接種后，培養(yǎng)24 h為陽性結(jié)果，質(zhì)譜鑒定為大腸埃希菌。其余9個陰性質(zhì)控均未培養(yǎng)出細菌。

2.2 兩種接種方法的單個菌落分離效果比較

930例標本中20例出現(xiàn)兩種接種方法“陰陽不符”的情況。在未能確認是操作污染、接種能力等因素所致的情況下，只選取兩種接種方法均陽性的標本進行單個菌落分離效果的比較。無論是尿液還是血/無菌體液標本，經(jīng)儀器接種比手工接種分離得到更多的單個菌落，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖1。

A:儀器法Z字劃線(尿)；B:手工法密集涂布(尿)；C:儀器法四區(qū)劃線(血)；D:手工法四區(qū)劃線(血)。

表1 兩種接種方法均陽性的標本接種效果的比較個)

2.3 兩種接種方法的接種陽性率比較

219例尿陽性培養(yǎng)標本和120例血陽性培養(yǎng)標本經(jīng)兩種接種方法接種得到一致的陽性率，均為100%。930例標本中，儀器法和手工法的接種陽性率為分別是37%和38%，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 930例標本兩種接種方法陽性率的比較(n)

2.4 兩種接種方法的尿培養(yǎng)結(jié)果比較

手工法接種的標本中，菌落總數(shù)大于或等于105cfu/mL和大于或等于104cfu/mL的標本都要比儀器法接種的多，菌落總數(shù)大于或等于102cfu/mL的標本卻比儀器法少；從分離得到的菌種數(shù)來看，手工法接種分離到1種或大于2種菌的標本要比儀器法多，而分離到2種菌卻比儀器法少，見表3。

表3 兩種接種方法的尿培養(yǎng)結(jié)果比較(n)

3 討 論

微生物檢測流程的復(fù)雜性使臨床微生物實驗室的自動化、智能化建設(shè)滯后于其他專業(yè)[6]。在廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院，實習生和進修生參與了大量標本接種的工作，因人員長期輪換且水平不一，很難實現(xiàn)標準化的操作。接種是微生物檢測流程的第一步，有無菌生長、菌落計數(shù)及菌種數(shù)直接影響檢驗人員對后續(xù)實驗的判斷。因此，確保微生物檢驗的質(zhì)量，必須盡可能實現(xiàn)標準化的操作。

2015年，廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院實驗室使用我國第1臺BD Kiestra InoqulA全自動標本處理系統(tǒng)。該儀器能通過自動識別標本類型、自動選擇培養(yǎng)皿種類、自動貼標簽、自動取樣，并通過磁珠在磁場的作用下進行劃線接種。近幾年國內(nèi)幾家醫(yī)院和第三方檢測平臺華銀也陸續(xù)裝上了Kiestra InoqulA，甚至包含了自動孵育系統(tǒng)和數(shù)字成像系統(tǒng)，實現(xiàn)了微生物檢驗全程自動監(jiān)測。在國外，從2014年至今已有不少BD Kiestra應(yīng)用的相關(guān)報道[8-10]，但在國內(nèi)尚無報道。FROMENT等[11]在2014年報道了BD Kiestra InoqulA在無交叉污染的情況下產(chǎn)生令人滿意的分離效果，比手工接種分離到了更多菌種類型。MORENO等[12]研究表明BD Kiestra InoqulA比傳統(tǒng)方法分離出更多的單個菌落。IVERSEN等[13]通過與Copan WASP對比，發(fā)現(xiàn)對于大于或等于105cfu/mL的尿標本，BD Kiestra有更高的分離率；在單個菌落上，后者同樣擁有更出色的分離效果。CROXATTO等[14]報道BD Kiestra InoqulA對于濃度大于107cfu/mL的標本也能分離出單個菌落，且比Copan WASP和手工接種分離得到更多的菌種，同時減少了實驗室的工作量與工作成本。甚至有研究發(fā)現(xiàn)，使用BD Kiestra InoqulA后，有更多的陰道加德納菌和放線菌從尿標本種分離出來[15]。

本實驗經(jīng)儀器接種的標本所得單個菌落數(shù)遠高于手工接種。圖1可見無論是尿標本“Z”字型劃線還是血/無菌體液四區(qū)劃線，都能清晰美觀地分離出不少單個菌落，避免了手工接種的參差和隨意。分區(qū)劃線的目的是為了分離出單個菌落，有無分出及分離的質(zhì)量，直接關(guān)系后續(xù)實驗的進程。本研究發(fā)現(xiàn)219例尿液標本經(jīng)兩種接種方法接種均陽性，而8例儀器法陽性而手工法陰性的標本中，6例均為菌落總數(shù)大于或等于102cfu/mL(平板上只有1個或少數(shù)幾個菌落生長)，對于恥骨上膀胱穿刺采集、膀胱導尿采集及經(jīng)前列腺按摩后排尿采集的尿液標本，菌落總數(shù)達到大于或等于102cfu/mL需要做鑒定或(和)藥敏試驗[16]，這或許是儀器優(yōu)越性能的體現(xiàn)；12例儀器法陰性而手工法陽性的標本中，1例大于或等于102cfu/mL，6例大于或等于104cfu/mL，5例大于或等于105cfu/mL。不可置否的是，儀器法采用經(jīng)校準的加樣槍和配套帶濾芯的槍頭加樣，和手工法的一次性定量接種環(huán)相比，其擁有更精確的加樣量。加之手工加樣涉及手工開關(guān)標本管、手工接種及劃線分離等可能出現(xiàn)錯誤的步驟。故手工法比儀器法多出4例的陽性或許跟上述原因有關(guān)。盡管兩種方法的陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但由于尿培養(yǎng)后續(xù)的鑒定及藥敏試驗跟菌落總數(shù)和菌種類別及菌種數(shù)直接相關(guān)，故保證加樣量、實行標準化操作必不可少。否則，個別報告的過度藥敏試驗或漏報，將影響臨床的診療決策。在分離的菌落總數(shù)和菌種數(shù)方面，其中兩例標本經(jīng)儀器法接種后，通過單個菌落更容易識別出有兩種菌生長，挑取單個菌落質(zhì)譜鑒定確認為兩種菌，而手工法分不出單個菌落。對于陽性血培養(yǎng)來說，第一時間識別出菌種的數(shù)量和種類，方能及時把一級報告反饋給臨床。假設(shè)能做到采血量準確、嚴格把控上機時間，那么通過標準化的標本處理得到的總菌落計數(shù)可以對血流感染的動態(tài)監(jiān)測起到更準確的指導意義。

綜上所述，BD Kiestra InoqulA全自動微生物標本處理系統(tǒng)與傳統(tǒng)的手工接種方法相比表現(xiàn)出了良好的性能。同時，本實驗為臨床微生物實驗室建立智能化管理提供了借鑒。