賈春麗,路鵬霏,邱 萍,楊 穎,吳 戈,張瑞麗,毛 睿,張 華

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，烏魯木齊 830000)

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，全球女性中每年新發(fā)乳腺癌患者約有200萬(wàn)，乳腺癌的發(fā)病率在逐年增長(zhǎng)[1]，嚴(yán)重威脅女性健康。而在我國(guó)，每年有上萬(wàn)例女性死于乳腺癌[2]。核苷三磷酸焦磷酸水解酶(NTP-PPase)可以水解核苷三磷酸(d)NTP的磷酸二酯鍵形成核苷單磷酸(d)NMP，釋放焦磷酸。NTP-PPase水解異常核苷酸明顯減少了細(xì)胞核苷酸池中的異常核苷酸，避免了DNA合成過(guò)程異常核苷酸的摻入，提高了DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性[3]。DCTPP1基因是NTP-PPase家族中的成員，具有NTP-PPase活性，有研究報(bào)道其為抗腫瘤藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)[4-5]，在DNA復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[6]。然而，目前對(duì)DCTPPl在臨床乳腺癌組織中的表達(dá)及功能等相關(guān)研究報(bào)道較少。本研究旨在利用腫瘤相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，明確DCTPPl在乳腺癌中的表達(dá)、分布狀態(tài)及與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，探討DCTPP1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的功能，為DCTPP1基因在乳腺癌中的研究奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

TCGA(The Cancer Genome，Atlas http://cancergenome.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)包括了腫瘤病例臨床基本信息，如基本資料，治療進(jìn)程，臨床分期，腫瘤病理及生存狀況，包括mRNA、microRNA、Copy Number、Mutation、Protein、Methylation信息等。利用ualcan(http://ualcan.path.uab.edu/)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中包括乳腺癌組織和及正常組織中的多種腫瘤組織及正常組織中DCTPP1基因mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行分析。Human Protein Reference Database是一個(gè)專門(mén)存儲(chǔ)人類蛋白質(zhì)相互作用信息的數(shù)據(jù)庫(kù)，在該網(wǎng)站查詢DCTPP1基因在乳腺癌組織及正常組織中蛋白的表達(dá)狀況。

1.2 方法

1.2.1生存分析

利用基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)數(shù)據(jù)庫(kù)加載了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)數(shù)據(jù)，利用其中乳腺癌患者DCTPP1基因mRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)分析DCTPP1基因表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)。

1.2.2病理亞型及年齡狀況

采用ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)中存儲(chǔ)的TCGA 數(shù)據(jù)分析DCTPP1基因在乳腺癌不同分期、病理亞型的表達(dá)狀況。

1.2.3蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

genemania數(shù)據(jù)庫(kù)可提供蛋白-蛋白，蛋白-DNA 和遺傳相互作用、通路、生理生化反應(yīng)等信息，利用該數(shù)據(jù)庫(kù)DCTPP1蛋白參與的蛋白-蛋白，遺傳相互作用和通路、蛋白共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4基因功能

WebGestalt是一個(gè)基因功能富集分析的在線網(wǎng)站，將與DCTPP1基因相互作用的關(guān)鍵基因利用WebGestalt進(jìn)行GO分析，了解其參與的細(xì)胞組分、生物過(guò)程、生物功能。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Kaplan-Meier生存分析計(jì)算生存率，采用logrank檢驗(yàn)估計(jì)生存率的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌組織及正常組織中DCTPP1基因的差異性表達(dá)結(jié)果

通過(guò)ualcan網(wǎng)站在線分析TCGA乳腺癌患者數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌基因表達(dá)的相關(guān)信息，對(duì)比1 097例乳腺癌組織與114例正常乳腺組織中DCTPP1基因mRNA的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常乳腺組織(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析乳腺癌組織及正常乳腺組織DCTPP1基因mRNA的表達(dá)水平

2.2 DCTPP1基因在乳腺癌不同分期、病理亞型的表達(dá)水平

基于ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，TNM臨床分期中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌患者癌組織中DCTPP1基因表達(dá)水平顯著高于正常乳腺組織(P<0.01)，Ⅲ期乳腺癌患者癌組織中DCTPP1基因表達(dá)水平與Ⅰ期乳腺癌組織中該基因的表達(dá)相比明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Luminal型乳腺癌患者癌組織中DCTPP1基因表達(dá)水平顯著高于正常乳腺組織(P<0.05)，HER-2過(guò)表達(dá)型、三陰型乳腺癌患者癌組織中DCTPP1基因表達(dá)水平明顯高于正常乳腺組織(P<0.05)，見(jiàn)圖2。各病理亞型乳腺癌組織中DCTPP1基因表達(dá)均高于正常乳腺組織(P<0.01),其中Lumnial型乳腺癌該基因的表達(dá)明顯高于三陰型乳腺癌(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

圖2 正常乳腺組織與不同分期乳腺癌組織中DCTPP1基因mRNA表達(dá)水平比較

圖3 正常乳腺組織與不同病理分型乳腺癌組織中DCTPP1基因mRNA表達(dá)水平比較

2.3 DCTPP1蛋白乳腺癌組織及正常乳腺組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，乳腺小葉癌組織中和乳腺導(dǎo)管癌組織中DCTPP1基因的表達(dá)呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性。進(jìn)一步觀察乳腺癌組織中DCTPPl蛋白陽(yáng)性的細(xì)胞分布格局，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核均有DCTPPl蛋白的表達(dá)，其中細(xì)胞質(zhì)淺棕黃色，細(xì)胞核及細(xì)胞膜呈棕褐色。在正常乳腺組織中，DCTPPl在部分腺體細(xì)胞表達(dá)，主要位于細(xì)胞核與細(xì)胞膜，在脂肪組織中不表達(dá)，見(jiàn)圖4。

A、B：浸潤(rùn)性癌；C、D：導(dǎo)管癌；E、F：正常乳腺組織。

2.4 DCTPP1基因表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析DCTPP1基因不同表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)，分析1 070例乳腺癌患者的總體生存時(shí)間，以DCTPP1基因表達(dá)的中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)將患者分為DCTPP1基因高表達(dá)組(n=535)與DCTPP1基因低表達(dá)組(n=535)，分析結(jié)果表明，相對(duì)于低表達(dá)的患者，DCTPP1基因高表達(dá)降低了乳腺癌患者總體生存時(shí)間(HR=1.9,P<0.01)，見(jiàn)圖5。

圖5 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中DCTPP1基因不同表達(dá)水平乳腺癌患者總體生存率分析

2.5 DCTPP1蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)及功能分析

genemania分析共篩選出20個(gè)DCTPP1基因相互作用蛋白質(zhì)：BAP1、CAPZB、CIAPIN1、CTPS1、HERC4、LGI1、LGI2、LGI3、LGI4、MRPL21、NUBP1、PCNA、PDE12、PLK1、POLR3K、RAD23A、TSPEAR、UBQLN1、WDR74、XPNPEP1，相互作用關(guān)系包括物理相互作用、共表達(dá)、共享蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域、共定位，見(jiàn)圖6。

圖6 DCTPP1基因相互作用蛋白分析

2.6 GO分析

對(duì)上述基因參與的生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白主要參與了代謝過(guò)程、生物調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞通信等過(guò)程。DCTPP1基因相關(guān)基因位于多種細(xì)胞成分中，包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、囊泡、線粒體、被膜等。分子功能包括結(jié)合蛋白質(zhì)、結(jié)合離子、水解酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性、結(jié)合核苷酸、結(jié)合核酸等，見(jiàn)圖7。

A：生物學(xué)過(guò)程；B：細(xì)胞組分；C：分子功能。

3 討 論

世界范圍內(nèi)，美國(guó)和北歐是乳腺癌高發(fā)，而亞洲地區(qū)發(fā)病率最低[7]，中國(guó)不是乳腺癌的高發(fā)國(guó)家，但由于人口基數(shù)龐大，每年女性乳腺癌新發(fā)病例的絕對(duì)數(shù)很多，位居世界第2位；每年因乳腺癌死亡的人數(shù)位列中國(guó)女性因腫瘤死亡人數(shù)的第6位[8-9]。近年來(lái)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、人表皮生長(zhǎng)因子受體、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑等靶向藥物在乳腺癌中的應(yīng)用逐漸增多，然而這些靶點(diǎn)僅存在于部分乳腺癌患者，因此尋找乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵分子或靶點(diǎn)，對(duì)開(kāi)發(fā)新的治療乳腺癌的靶向藥物具有重要意義。

人體內(nèi)的正常細(xì)胞在不斷進(jìn)行自我更新，其中極為關(guān)鍵步驟是DNA復(fù)制，而該過(guò)程是細(xì)胞中是一個(gè)非常準(zhǔn)確的過(guò)程，每代每個(gè)基因產(chǎn)生10-7個(gè)錯(cuò)誤[10]，該過(guò)程出現(xiàn)差錯(cuò)會(huì)導(dǎo)致基因發(fā)生突變，發(fā)生突變細(xì)胞中的一部分細(xì)胞就會(huì)變成前癌細(xì)胞。在人體內(nèi)腫瘤微環(huán)境的作用下前癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞內(nèi)異常核苷酸代謝對(duì)于腫瘤微環(huán)境的形成和維持、腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移等有著非常重要的作用[11]。

NTP-PPase家族在低等的原核生物和高等真核生物中都存在，該酶水解底物包括核苷三磷酸和異常核苷三磷酸[3]。NTP-PPase若缺失會(huì)導(dǎo)致DNA突變的增加，并影響細(xì)胞分裂。如大腸桿菌的MutT酶可以選擇性清除核苷酸池中的氧化核苷酸8-oxo-dGTP和2-OH-dATP，這一過(guò)程阻止了氧化應(yīng)激導(dǎo)致的異常核苷酸摻入到DNA中造成的DNA損傷。在大腸桿菌中MutT的缺失導(dǎo)致大腸桿菌的AT-CG突變率大大增加[12]。在結(jié)核分枝桿菌中的MazG水解dUTP、2-hydroxy-dATP和8-oxo-dGTP等，該酶缺失可以造成編碼利福平抗性基因的突變明顯增多，從而影響結(jié)核分枝桿菌的正常生長(zhǎng)[13]。因此，NTP-PPase在生物過(guò)程中不斷分解細(xì)胞代謝過(guò)程中的異常核苷酸，保證了DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性及生物體基因組的穩(wěn)定性。而作為被在人類細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的具有典型MazG結(jié)構(gòu)域的NTP-PPase，DCTPP1基因是眾多已發(fā)現(xiàn)的NTP-PPase中研究報(bào)道較少的活性蛋白分子，對(duì)其酶學(xué)特性及功能研究結(jié)果提示該分子可以特異性水解dCTP和結(jié)構(gòu)類似物如5-甲基-dCTP和5-鹵-DCTP[14]。

ZHANG等[4]研究多種腫瘤中DCTPP1基因的表達(dá)模式及與對(duì)應(yīng)的癌旁組織之間的表達(dá)差異，與癌旁組織中的表達(dá)進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在肺癌組織中DCTPP1基因顯著高表達(dá)，而DCTPP1基因在胃癌及結(jié)直腸癌中的表達(dá)并沒(méi)有顯著差異，同時(shí)在不同組織學(xué)亞型的腫瘤中表達(dá)狀況也不同。本研究結(jié)果顯示，DCTPP1基因在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于正常乳腺組織。這與上述腫瘤中DCTPP1基因的表達(dá)模式相同。DCTPP1基因在乳腺癌不同分期、不同分子病理分型(Lumnial型、HER-2陽(yáng)性過(guò)表達(dá)型、三陰型)的表達(dá)均較正常組織高，且以Lumnial型、三陰型明顯。在Human Protein Reference Database數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)乳腺癌組織及正常乳腺組織采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)DCTPP1蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，DCTPP1蛋白在乳腺導(dǎo)管癌及小葉癌中的表達(dá)均高于正常乳腺組織，SONG等[14]研究了161例乳腺癌組織和132例癌旁組織，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示DCTPP1基因在癌組織中過(guò)表達(dá)，且在細(xì)胞核中的表達(dá)濃聚，這與本課題組研究結(jié)果一致，DCTPP1基因與腫瘤密切相關(guān)。

本課題組分析1 070例乳腺癌患者的總體生存時(shí)間后發(fā)現(xiàn)高表達(dá)DCTPP1基因的乳腺癌患者總體生存時(shí)間明顯縮短，MORISAKI等[15]在對(duì)胃癌干細(xì)胞的蛋白組學(xué)進(jìn)行比對(duì)分析后研究發(fā)現(xiàn)DCTPP1基因的活化轉(zhuǎn)移可能與胃癌干細(xì)胞中DNA的復(fù)制相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)DCTPP1基因的高表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后不良有關(guān)。LU等[16]在前列腺癌中也有同樣的發(fā)現(xiàn)，提示DCTPP1基因與乳腺癌、前列腺癌、胃癌的不良預(yù)后相關(guān)，提示DCTPP1基因可能是腫瘤患者預(yù)后不良因素。

REQUENA等[17]探究了DCTPP1基因在細(xì)胞核苷酸同源性中的作用,研究了這種酶的廣泛表征,發(fā)現(xiàn)該酶在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和線粒體中普遍存在,在正常細(xì)胞代謝過(guò)程中,DCTPP1基因可催化dCTP水解成dCMP，從而將dCMP池維持在胸苷酸合成的水平。dCTP/dTTP的適當(dāng)比例對(duì)于維持核苷酸庫(kù)中生理穩(wěn)態(tài)十分重要。DCTPP1基因在細(xì)胞中的活性可能參與核苷酸庫(kù)中dCTP濃度的調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞內(nèi)核苷酸庫(kù)中dCTP/dTTP 的比例?，F(xiàn)有研究顯示NTP-PPase細(xì)胞代謝過(guò)程中的消除異常的核苷酸，發(fā)揮著“清理門(mén)戶”功能[3]。XIA等[5]隨后在對(duì)胃癌中的研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的DCTPP1基因通過(guò)對(duì)MDRl的去甲基化作用促進(jìn)了胃癌對(duì)化療的耐藥性。通過(guò)與DCTPP1基因相關(guān)的蛋白進(jìn)一步探究DCTPP1基因的功能發(fā)現(xiàn)，此類蛋白廣泛分布于細(xì)胞各個(gè)結(jié)構(gòu)中，參與細(xì)胞的代謝生長(zhǎng)過(guò)程，蛋白結(jié)合過(guò)程。LU等[16]研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)DCTPP1基因促進(jìn)前列腺癌腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。REQUENA等[18]在對(duì)人宮頸癌細(xì)胞株Hela的研究發(fā)現(xiàn)DCTPP1基因可增加化療藥物的抗腫瘤活性。王佳琦等[19]研究證實(shí)雷公藤可以直接與DCTPP1基因相互作用，抑制DCTPP1基因酶的活性從而干預(yù)腫瘤的發(fā)生。

綜上所述，DCTPP1基因在乳腺癌組織中高表達(dá)，且與乳腺癌患者不良預(yù)后相關(guān)，可能參與了乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程，對(duì)該基因進(jìn)一步研究可協(xié)助評(píng)估患者預(yù)后并為乳腺癌的治療提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。