王圓圓，陳 晴，趙 晗，王婧蓉，何長江，葉小利

(西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

膿毒癥是指由感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征，是燒傷、創(chuàng)傷、感染、休克等臨床急危重患者的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，其發(fā)生率、病死率均較高。膿毒癥可進(jìn)一步發(fā)展為重癥膿毒癥、膿毒癥休克、多器官功能障礙綜合征(MODS)[1-2]。有調(diào)查顯示膿毒癥已成為重癥監(jiān)護(hù)病房僅次于心臟病的主要死亡原因[3]。研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥的發(fā)病機(jī)制、病理生理機(jī)制是十分復(fù)雜的，不僅包括宿主、免疫、炎癥及凝血功能異常等多個方面，同時還涉及許多器官及系統(tǒng)，也包括信號通路的參與。盡管已有許多文獻(xiàn)研究、臨床病理深入觀察，但其作為一種失調(diào)的免疫過程，一系列炎性反應(yīng)、凝血功能障礙的發(fā)生，阻礙了提升救治水平、降低死亡率的進(jìn)展。因此，積極尋找針對性措施阻止病情的進(jìn)一步發(fā)展，深入探討膿毒癥發(fā)生、發(fā)展的病理生理機(jī)制是極重要的。

盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture,CLP)被認(rèn)為是進(jìn)行膿毒癥研究的金標(biāo)準(zhǔn)[4]，CLP模型已有30多年的應(yīng)用歷史,是研究膿毒癥潛在機(jī)制的理想模型[5],主要優(yōu)點(diǎn)是能夠誘導(dǎo)不同嚴(yán)重程度的膿毒癥[6]?，F(xiàn)有證據(jù)表明，炎性反應(yīng)隨著膿毒癥的嚴(yán)重程度而變化，這在很大程度上取決于盲腸結(jié)扎的程度[1,7]。本實(shí)驗(yàn)擬通過對小鼠進(jìn)行不同程度的CLP，以誘發(fā)不同嚴(yán)重程度的膿毒癥，比較其病理變化程度，并對手術(shù)操作步驟進(jìn)行改良，分析誘導(dǎo)膿毒癥的標(biāo)準(zhǔn)化程序，綜合評估更符合臨床病理過程的膿毒癥模型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

無特殊病原體(SPF)級KM雄性6周齡小鼠50只，體重35～42 g，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供。小鼠平衡飼養(yǎng)5 d，飼養(yǎng)于西南大學(xué)藥學(xué)院SPF級動物實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(渝)2014-0002]。飼養(yǎng)條件：溫度23～24 ℃，濕度(50±10)%，12 h光照/黑暗循環(huán)，自由飲水?dāng)z食。ELISA試劑盒[腫瘤壞死因子-α(TNF-α，SU-BN20852)、白細(xì)胞介素-6(IL-6，SU-BN20188)]購于福建省泉州市睿信生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分5組：空白對照(NC)組，假手術(shù)(Sham)組，以及根據(jù)盲腸的結(jié)扎部位分為輕度膿毒癥(Min)組、中度膿毒癥(Mod)組和重度膿毒癥(Sev)組，每組10 只；NC組不做任何處理，Sham組僅行開腹、關(guān)腹程序。

1.2.2手術(shù)方法

用10%水合氯醛麻醉小鼠，使用脫毛膏/電動修剪器剃掉小鼠腹部的毛，并用75%乙醇及聚維酮碘消毒該區(qū)域。在腹白線靠右切開腹腔約2 cm，找出盲腸后用 5-0 縫線分別結(jié)扎盲腸的不同位置(圖1)：Min組盲腸結(jié)扎程度為1/3(圖2A)、Mod組為1/2(圖2B)、Sev組為2/3盲腸(圖2C)，以21G 針頭貫通穿刺結(jié)扎的盲腸2次。為確保通暢，用消毒鑷子適度擠壓讓微量腸內(nèi)容物從穿刺孔溢出；將處理好的盲腸回納入腹腔，縫合內(nèi)層用5-0縫線，閉合外層用3-0 縫線，見圖3。在15 min內(nèi)完成每只小鼠的手術(shù)流程。待小鼠蘇醒后自由飲水，正常飼養(yǎng)，并觀察記錄小鼠生理狀況。

圖1 盲腸結(jié)扎部位示意圖

A:Min組;B:Mod組;C:Sev組。

A:麻醉并脫毛;B:切開腹腔;C:找出盲腸;D:盲腸結(jié)扎;E:穿孔;F:縫合。

1.2.3觀察指標(biāo)

(1)評估24 h內(nèi)小鼠臨床癥候、生存狀況；(2)各組死亡率比較；(3)解剖小鼠肝臟及盲腸組織，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察形態(tài)變化；(4)24 h后進(jìn)行小鼠眼眶取血，檢測炎性因子水平，包括TNF-α、IL-6。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組臨床癥候觀察

NC組：反應(yīng)敏捷，精神、食欲、大小便均正常，毛發(fā)均勻光澤。Sham組：蘇醒后精神較好，小鼠大多舔舐傷口，能自由進(jìn)行取食、飲水等活動。Min組：蘇醒時間與假手術(shù)組相差不大，醒后身體蜷縮，基本不活動，進(jìn)食減少，進(jìn)水頻率較高，對外界反應(yīng)較遲鈍，呼吸頻率加快，大部分小鼠扎堆取暖，排便部分呈現(xiàn)黏著狀態(tài)。12 h后沒有小鼠死亡，20 h后小鼠開始死亡，24 h后死亡率約20%。Mod組：蘇醒延遲，醒后精神萎靡，身體蜷縮，基本不活動，進(jìn)食、進(jìn)水減少，大便稀軟，體溫明顯降低，小部分小鼠扎堆取暖。12 h內(nèi)有部分小鼠死亡，12 h后小鼠死亡數(shù)目增多，24 h后死亡率約40%。Sev組：所有小鼠不再扎堆取暖，12 h內(nèi)死亡率達(dá)90%。剖腹可見惡臭味血性滲液，腸管水腫粘連，盲腸壞死變黑。

2.2 各組死亡率比較

24 h內(nèi),盲腸結(jié)扎程度為1/3的Min組，其死亡率約為20%；盲腸結(jié)扎程度為1/2的Mod組，死亡率為40%；盲腸結(jié)扎程度為2/3的Sev組，小鼠死亡率為90%。Min組的致死高峰期相比于Mod組，會在更晚期出現(xiàn)，Sev組的死亡高峰集中于前12 h。

2.3 HE染色結(jié)果分析

光鏡下結(jié)果顯示，NC組小鼠盲腸組織、肝組織形態(tài)正常，組織纖維結(jié)構(gòu)排列緊密；Sham組小鼠與NC組差異不大。Mod組小鼠盲腸組織結(jié)構(gòu)有嚴(yán)重?fù)p傷，出血和細(xì)胞壞死脫落，白細(xì)胞浸潤，腸部黏膜水腫，細(xì)胞邊界模糊；肝臟組織結(jié)構(gòu)被破壞，出現(xiàn)急性炎癥損傷，微血栓、淤血及空泡脂肪樣變性，少數(shù)細(xì)胞有輕微水腫；病理變化程度Sev組最重，Min組最輕。結(jié)果顯示，不同結(jié)扎部位皆能誘導(dǎo)小鼠感染膿毒癥，且病變程度隨著結(jié)扎程度的加深而加重，但Mod組效果呈現(xiàn)最為典型，見圖4。

A、B:NC組小鼠盲腸組織;C:NC組小鼠肝臟組織;D、E:Mod組小鼠盲腸組織；F:Mod組小鼠肝臟組織。

2.4 各組炎性因子水平比較

與NC組比較，Sham組IL-6、TNF-α水平無明顯變化(P>0.05)，Mod組IL-6、TNF-α水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組炎性因子水平比較

3 討 論

膿毒癥及其引起的膿毒癥休克和多器官衰竭病情兇險(xiǎn),會引發(fā)多系統(tǒng)功能障礙[8]，是ICU患者死亡的重要原因[9]。研究顯示許多存活膿毒癥患者合并不同程度的免疫抑制,機(jī)體表現(xiàn)出持續(xù)低水平炎性反應(yīng)及進(jìn)展性免疫抑制等免疫失衡狀態(tài)[10]。

在膿毒癥早期，為發(fā)揮對機(jī)體的保護(hù)作用，心、腦、肺、肝和腎等多個重要器官中自噬開始被誘導(dǎo)，后期隨著免疫細(xì)胞功能抑制，機(jī)體進(jìn)入持續(xù)的免疫抑制期。且研究發(fā)現(xiàn)，用自噬抑制劑來阻斷自噬，則在膿毒癥發(fā)病前期4～6 h，脂多糖誘發(fā)炎癥加深，使得器官功能受損，呈現(xiàn)為組織器官損傷，也進(jìn)一步導(dǎo)致小鼠死亡率升高。再者，膿毒癥中出現(xiàn)機(jī)體自我防御的炎性反應(yīng)，其中有重要的誘導(dǎo)促凝血作用的是多種細(xì)胞炎性因子[11]，其大量釋放，通過促凝作用引起微循環(huán)障礙，造成膿毒癥免疫抑制及功能紊亂，細(xì)胞因子分泌失調(diào)[1,7]。炎癥誘導(dǎo)凝血反應(yīng)，而凝血的激活又促進(jìn)炎性反應(yīng)，全身炎性反應(yīng)則加重凝血激活和級聯(lián)反應(yīng)。膿毒癥病發(fā)過程中，其釋放的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡缀痛傺變纱箢悾傺准?xì)胞因子主要在早期膿毒癥病理變化中產(chǎn)生，主要包括TNF-α、IL-2、IL-6等，抗炎介質(zhì)有IL-4、IL-10、IL-13。其中TNF-α是炎癥早期最主要的促炎細(xì)胞因子[12]，是內(nèi)毒素?fù)p傷效應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，介導(dǎo)作用于凝血過程及相關(guān)通路變化[13]。IL-6是在其他炎性因子作用下產(chǎn)生的炎性介質(zhì)，是促炎遞質(zhì)的核心成員。有研究表示，IL-6水平可以作為反映感染嚴(yán)重程度的指標(biāo)，且直接與膿毒癥的預(yù)后相關(guān)[14]。同時，在凝血過程中血小板的激活可以導(dǎo)致某一種配體CD40的釋放，這種配體可促使IL-6合成增加，表明炎癥通路的確立是膿毒癥患者病理機(jī)制的關(guān)鍵。

本研究中，優(yōu)化后的CLP膿毒癥模型也存在缺點(diǎn)，即評價(jià)模型是否成功建立的指標(biāo)比較局限[15]。傳統(tǒng)的CLP手術(shù)步驟，對于針孔大小、結(jié)扎穿孔位置及程度等被證實(shí)決定最終死亡率的指標(biāo)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化[16]，不同結(jié)扎穿孔的膿毒癥模型雖皆能誘導(dǎo)小鼠感染膿毒癥，且病變程度隨著結(jié)扎程度的加深而加重，但Min組小鼠病變程度較低，Sev組小鼠病變程度較重，且病發(fā)速度過快，小鼠死亡率較高，檢測急性炎性因子水平和驗(yàn)證模型成功率往往難以實(shí)現(xiàn)，故兩者都難以對比模擬臨床病癥的真實(shí)情況。而Mod組效果明顯，且小鼠病發(fā)速度可控，呈現(xiàn)狀態(tài)最為典型，是進(jìn)行膿毒癥致病機(jī)制研究和抗炎藥物篩選較好的動物模型。本實(shí)驗(yàn)雖探究了不同程度盲腸結(jié)扎穿孔的死亡率，但模擬臨床膿毒癥模型的建立還需在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索，方便推廣與應(yīng)用。

本課題組對CLP的標(biāo)準(zhǔn)化手術(shù)流程進(jìn)行改進(jìn)，有以下2點(diǎn)總結(jié)：(1)傳統(tǒng)CLP往往采用1～2 cm的中線縫合來完成手術(shù)，對于月齡較小、體重較小的小鼠易造成術(shù)中死亡或術(shù)后局部切口感染，小鼠死亡率由此增高。本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)通過改變切口位置至中線偏右3～5 mm，使對盲腸進(jìn)行操作時手術(shù)視野更優(yōu)，從而縮小了手術(shù)切口。通過觀察發(fā)現(xiàn)，手術(shù)切口越小，無關(guān)感染率越低，小鼠術(shù)后蘇醒越快，而縮小后的手術(shù)切口所帶來的弊端則是手術(shù)過程中盲腸組織難以被發(fā)現(xiàn)和進(jìn)行手術(shù)處理，需要操作者仔細(xì)觀察。同時，在實(shí)驗(yàn)操作中，發(fā)現(xiàn)因小鼠生理差異，存在少數(shù)盲腸末端位于腹腔左側(cè)，壓于組織器官之下，給實(shí)驗(yàn)操作帶來極大難度，需要加大手術(shù)切口尋找盲腸位置，極易造成其他黏膜、組織出血或損傷。SOMMER等[17]曾對CLP小鼠模型的切口愈合狀況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在膿毒癥模型組中，小鼠切口愈合能力下降，不僅使CLP術(shù)后傷口愈合時間延長，而且會影響遠(yuǎn)處傷口的愈合。因此，在膿毒癥動物模型手術(shù)過程中，可在實(shí)驗(yàn)前通過光照對比，大致確定盲腸末端位置(光下呈明顯灰黑色)后，在實(shí)驗(yàn)時縮小手術(shù)切口，集中于觀測到的盲腸末端，可有效縮短實(shí)驗(yàn)時間，降低術(shù)后切口局部的感染風(fēng)險(xiǎn)。(2)嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)時間，把握手術(shù)流程的標(biāo)準(zhǔn)化。掌握從剪開外皮至縫紉外皮耗時15 min，除必要的尋找盲腸、結(jié)扎穿孔需要耗費(fèi)10 min，可通過減少縫紉小鼠外皮傷口的方法來縮短手術(shù)時間。已有研究顯示可用金屬傷口閉合夾進(jìn)行外皮的閉合處理，故而在正式實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)對部分小鼠進(jìn)行金屬傷口閉合夾的試用，具體為術(shù)前用75%乙醇及聚維酮碘浸泡15 min，再進(jìn)行內(nèi)皮5-0 縫線縫紉、閉合外層用3-0縫線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能有效縮短手術(shù)時間至15 min內(nèi)，同時減少了外皮縫合中可能出現(xiàn)的出血、感染情況。

綜上所述，本研究采用CLP建立膿毒癥小鼠模型，其中Mod模型是一種理想的動物模型。此外，通過炎性因子作用通路，分子對接表達(dá)也可以作為判斷感染的指標(biāo)之一，有助于膿毒癥的診斷和治療，為進(jìn)一步靶向治療膿毒癥提供了新的研究方向。