鄧玲 賀靜

β-地貧是遺傳性血液病，由β-珠蛋白基因（hemoglobin subunit beta，HBB），發(fā)生突變引起，是全球最常見的單基因疾病。HBB基因編碼成人血紅蛋白（adult hemoglobin，HbA）的β 亞基，HBB基因突變可消除或減少β-珠蛋白的合成，從而導致無效的紅細胞生成，進而導致慢性溶血和嚴重貧血［1］。β-地貧根據(jù)病情輕重，可以分為三類：輕度、中度和重度。通常情況下，輕度地貧無需特殊治療。中度和重度地貧主要采取以下方式：除鐵治療、輸血治療、骨髓造血干細胞異體移植、脾切除手術等［2］。其中，異體造血干細胞移植是根治地貧的方法，但費用巨大，且配型極其困難；其他方法只能夠維持地貧患者生命，同樣給家庭帶來極大經(jīng)濟負擔，且需消耗大量血液資源，患者生活質(zhì)量極低，不能從源頭上根治該疾病。近年來，基因編輯技術已被應用于基因治療β-地貧的多項相關研究中，它通過插入、缺失或替換的手段對基因組進行靶向編輯，能讓正?；蛱鎿Q突變基因，代替有缺陷的β-珠蛋白；或重新開啟γ-珠蛋白基因（hemoglobin subunit gamma，HBG）的表達，使γ-珠蛋白增加，這樣就可以結合患者紅細胞中過多的α-珠蛋白鏈，緩解β-地貧患者的貧血程度。因此基因編輯技術很有可能成為緩解甚至治愈β-地貧的治療方法。目前，針對β-地貧的基因治療策略主要分為兩種，慢病毒介導的基因轉(zhuǎn)移和基于基因編輯技術的策略。這兩種策略都是通過遞送具有正常生物學功能的HBB基因或基因編輯后的基因至患者的造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC），代替突變的HBB基因完成工作（圖1）。

圖1 β-地中海貧血基因治療方法［3］Figure 1 Therapeutic Approaches forβ-thalassemia［3］

1 病毒載體介導的基因治療

病毒載體介導的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)是目前使用最多的，常用的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒（retro virus，RV）、慢病毒（lentivirus，LV）和腺相關病毒（adeno associated virus，AAV）［4］。但是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體存在一定的局限性和安全隱患，而腺相關病毒載體雖然安全性有所提高但不能包裝較大的DNA。慢病毒載體可以穩(wěn)定攜帶較大的基因如HBB基因，具有將復雜的基因結構轉(zhuǎn)移到靜止的造血干細胞中的能力，并且制備簡單、安全性較好，因此慢病毒載體是目前β-地貧患者基因治療最有效的基因治療轉(zhuǎn)移載體，它為β-地貧的基因治療提供了可行性。

1.1 通過導入正常外源基因使體內(nèi)產(chǎn)生正常的β-珠蛋白

通過將功能正常的HBB基因有效的導入患者的HSCs 中，使患者體內(nèi)產(chǎn)生正常的β-珠蛋白，從而改善β-地貧患者的臨床癥狀。2016年，Negre等［5］發(fā)現(xiàn)在β-地貧患者中通過慢病毒轉(zhuǎn)移有標記的β-珠蛋白（βA-T87Q）基因進行的基因治療可替代長期輸血。2018年，Thompson 等［6］的研究中，在輸血依賴型β-地中海貧血（Transfusion-Dependent β-Thalassemia，TDT）患者身上獲得了自體CD34+細胞，在體外應用LentiGlobin BB305 載體編碼攜帶T87Q 這一氨基酸取代的成人血紅蛋白（HbAT87Q）。經(jīng)轉(zhuǎn)導和HSCs 移植，患者體內(nèi)HbAT87Q在26 個月后逐步增加并穩(wěn)定表達，其中3例β0/β0患者已停止輸血，年平均輸血量減少73%。這項臨床試驗的結果提示細胞基因治療可能是地中海貧血治療領域的發(fā)展趨勢。

1.2 通過shRNA 敲低BCL11A 重新激活HBG 基因表達

Hb F 的構成為α2γ2，編碼γ-珠蛋白的HBG基因在胎兒出生后逐漸關閉表達［7］。重新激活患者體內(nèi)HBG基因的表達，是治療或緩解地貧的一個重要策略［8］。HBG基因表達受多種調(diào)控元件調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄抑制因子BCL11A是影響其表達的重要因素［9］。但BCL11A在造血干細胞和祖細胞中的普遍敲除會損害移植后的造血重建。因此對BCL11A的紅細胞特異性敲除可以避免移植造血干細胞的毒性［10］。Brendel 等［11-12］將shRNA（short hairpin RNA）嵌入microRNA（shRNAmiR）中，并將其與HBB基因啟動子以及僅在紅細胞前體中起作用的調(diào)節(jié)元件連接在一起，最后將其插入經(jīng)過改造的慢病毒載體中。該研究表明，這種使BCL11A沉默的基因療法既可促使HBG基因的重新激活，增加HbF 的表達水平，又可抑制鐮狀血紅蛋白的表達。然而，紅系譜系中BCL11A在B 淋巴細胞和造血干細胞的發(fā)育中起著至關重要的作用，BCL11A的完全失活會對人類紅細胞的去核產(chǎn)生不利影響。相比之下，破壞BCL11A紅系增強子中雙等位基因上的GATAA 序列不會對去核產(chǎn)生負面影響［10］。因此，目前針對BCL11A基因調(diào)控的研究，主要集中在它的紅系增強子上，以提供一種安全的治療方法。

1.3 通過改變β-珠蛋白基因座的染色質(zhì)結構重新激活HBG 基因表達

β-珠蛋白基因座的主要轉(zhuǎn)錄增強子，稱為座位調(diào)控區(qū)（locus control region，LCR），由多個紅系特異性DNaseⅠ超敏位點組成［2］。在紅系細胞中，LCR 以發(fā)育階段特異性方式接觸類β-珠蛋白基因以刺激轉(zhuǎn)錄。通過染色質(zhì)環(huán)化與HBG基因相互作用，這一過程需要蛋白質(zhì)LDB1 的介導［13］。在成人紅系細胞中，通過人工鋅指蛋白將LDB1 連接到HBG基因啟動子，這種方法誘使LCR 與HBG基因啟動子之間形成了一個環(huán)，最終重新激活了內(nèi)源性γ-珠蛋白的表達，同時降低了鐮狀血紅蛋白的水平［14］。驅(qū)動染色質(zhì)環(huán)化可以控制珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄的平衡，盡管此方法目前只在小鼠和成人紅系細胞中進行了研究，但提供了一種新的方法進行基因治療。目前還需進行臨床前的體內(nèi)研究，探討這種策略在人體體內(nèi)的安全性和特異性。

2 基因編輯技術介導的基因治療

在過去的幾十年里，基因組編輯技術的發(fā)展已經(jīng)可以在體外和體內(nèi)對許多不同的細胞類型進行靶向修飾，并已開發(fā)出了多種基因編輯工具，包括鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活樣效應因子核酸酶（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR 相關蛋白（CRISPR-associated proteins，Cas）系統(tǒng)［15］。基因編輯通過人工核酸內(nèi)切酶精確靶向誘導DNA 雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks，DSBs），激活細胞啟動兩種天然修復機制：同源重組修復（homologydirected repair，HDR）或非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ），對DSBs 進行修復［16］。

NHEJ 是一個高效的修復系統(tǒng)，在修復過程中能夠在DSBs 位點產(chǎn)生堿基隨機插入或缺失，最終引起蛋白質(zhì)翻譯的提前終止，從而抑制基因功能，實現(xiàn)目的基因的敲除。而HDR 是一種高保真的修復機制，使用同源DNA 作為修復模板，供體中的外源目的基因會通過同源重組過程完整的整合到靶位點，實現(xiàn)突變基因的校正［17-18］。雖然NHEJ介導的編輯效率比HDR 介導的編輯效率高，但HDR 修復方法可以實現(xiàn)精準的DNA 編輯。

2.1 對突變基因的原位修復

與慢病毒介導的基因療法相似，基因編輯可用于對β-地貧患者的離體HSC 進行體外校正，以治療β-地貧。理想情況下，可以通過HDR 對HSC中的HBB基因進行校正，從而產(chǎn)生健康的紅細胞。Patsali 等［19］針對β-地貧中剪接異常進行了修復，通過破壞異常調(diào)控元件（disruption of aberrant regulatory elements，DARE）的方式，使用CRISPR/Cas9 和TALEN 工具對HBB基因上的IVS-I-110（G＞A）突變進行了修復。此外Xu 等［20］分別使用CRISPR/Cas9 和Cas12a 對β-地貧中常見的HBBIVS-I-110（G＞A）和IVS-2-256（C＞T）突變進行基因編輯，結果顯示編輯過的患者造血干細胞的紅系后代顯示異常剪接的逆轉(zhuǎn)和β-珠蛋白表達的恢復。

對于外顯子突變需要精確修復才能恢復基因的正常功能。Liu 等［21］修復了β-地貧患者誘導多能干細胞（induced piuripotent stem cell，iPSC）中CD41/42（-TCTT）突變，經(jīng)編輯后的細胞有HBBmRNA 的表達。而Wattanapanitch 等［22］利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)靶向修復了HbE/β-地貧患者來源的iPSC 中的CD26（G＞A）突變，但是研究發(fā)現(xiàn)HBBmRNA 和β-珠蛋白含量無明顯上升，推測可能是由HBB基因表達需要的轉(zhuǎn)錄因子如BCL11A水平低而引起的。因此對于修復是否成功需要考慮到修復后的基因能否轉(zhuǎn)錄出正常的mRNA，并且翻譯后能否產(chǎn)生正常的蛋白質(zhì)。

針對像β-地貧這種主要由單堿基突變引起的遺傳性疾病，除了用CRISPR/Cas9 技術進行原位修復外還可以通過單堿基編輯技術（base editors，BEs）對突變進行精確修復。Zeng 等［23］對HBB基因上的-28（A＞G）突變進行了單堿基編輯，結果顯示有36.4%的突變實現(xiàn)了精確修復，雖然單堿基編輯介導的精確修復效率還需進一步提高，但是分化后的紅細胞體積和形態(tài)都恢復至接近健康水平。該項研究表明單堿基編輯技術在造血干細胞的基因治療應用中的巨大潛力，可以為β-地貧的臨床治療提供新的解決方案。

2.2 編輯r-珠蛋白阻遏物激活HbF 表達

Canver 等［24］發(fā)現(xiàn)BCL11A 上的紅系增強子可作為HbF 重新產(chǎn)生的作用靶點。Wu 等［25］研究表明通過CRISPR/Cas9基因編輯技術編輯β-地貧和鐮刀狀貧血患者HSC 中的BCL11A 增強子的DNaseⅠ超敏位點+58，并進行自體HSC 移植，可以使得體內(nèi)分化產(chǎn)生具有高比例HbF 及正常功能血紅蛋白的紅細胞，表明CRISPR/Cas9 介導的基因編輯技術有望治愈由β-珠蛋白突變引發(fā)的遺傳疾病。

2.3 編輯HBG 基因阻遏物結合位點模擬HPFH突變

遺傳性胎兒血紅蛋白增高癥（Hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH）是一種良性血紅蛋白病，該病的發(fā)生是由于基因缺陷使HBG基因在成年期都持續(xù)表達的結果［26］。Martyn 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，HPFH 是由HBG基因轉(zhuǎn)錄起始點上游約115 bp 和200 bp 處的點突變引起的，突變破壞了轉(zhuǎn)錄抑制因子（BCL11A和ZBTB7A）與啟動子的結合，從而使HBG基因表達。Wang 等［28］采用基因編輯技術模擬HBG啟動子區(qū)13 bp 缺失和-114C＞T 這2種HPFH 中存在的突變，破壞了BCL11A結合域，從而解除對HBG表達的抑制，恢復HbF 水平，以達到治療效果。此外，研究人員利用單堿基編輯技術直接作用于HBG基因啟動子區(qū)，使-114 和-115 位點的C 突變?yōu)門，重新激活HbF 的表達。在Humbert等［29］使用非人靈長類動物模型，利用CRISPR-Cas9技術將相關基因修飾引入到特定的造血干細胞和祖 細 胞（hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs）亞群中，編輯后的細胞有效且穩(wěn)定地重新激活了HbF，對治療6 個月后的骨髓樣本分析發(fā)現(xiàn)具有分化成完整的血細胞的功能。在一年半的監(jiān)測期間沒有發(fā)現(xiàn)對成熟血細胞有不利的影響。

3 β-地貧基因治療的臨床應用

近年來隨著技術的快速發(fā)展，β-地貧的基因治療臨床應用也取得了顯著進展。2019年慢病毒基因療法Zynteglo，獲得歐盟批準上市，這是全球首個獲批用于治療β-地貧的基因療法［30］。2020年Zynteglo 在德國推出上市，這是該療法的首次商用。Zynteglo 通過用BB305 慢病毒載體轉(zhuǎn)導自體CD34+細胞，將修飾的β-珠蛋白基因的功能性拷貝添加到患者的HSC 中旨在糾正TDT 患者紅系細胞中β/α-珠蛋白平衡。Zynteglo 在歐盟的批準下進行多項臨床試驗，在這些臨床試驗中，高達75%～80%的患者擺脫了對輸血的依賴，已有患者近6年沒有接受輸血，和過去頻繁的輸血相比，是一個重大進步。但2021年2月，該臨床試驗已暫停，原因是曾經(jīng)參加此臨床試驗的兩名患者被診斷為急性髓細胞白血病和骨髓增生異常綜合征［31］。雖然目前還不能明確這一癥狀與慢病毒基因療法的關系，但是對于基因療法的安全性問題至關重要，對臨床試驗必須要長期持續(xù)監(jiān)測患者的安全性。

目前已經(jīng)用于臨床試驗的CTX001 是針對患有嚴重β-地貧患者采用CRISPR 基因編輯技術的造血干細胞療法。CTX001 通過剪切BCL11A基因來促進HbF 的產(chǎn)生從而實現(xiàn)治療目的。該方法從患者體內(nèi)分離出造血干細胞，在體外進行編輯，然后再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。2020年，F(xiàn)rangoul 等［32］報道的一例β-地貧患者在接受CTX001 治療后，臨床效果較好。在接受CTX001 治療后，患者的HbF在入組臨床試驗時只有0.3 g/dL，治療后3 個月后就升到8.4 g/dL，18 個月時就升到13.1 g/dL。在21.5 個月的隨訪期內(nèi)，再也沒有進行過輸血。在該研究中，CTX001 對β-地貧體現(xiàn)了出色的治療效果，整體安全性比較好，雖然隨訪時間還不夠長，但這已經(jīng)讓“一次性治愈”初現(xiàn)希望。

4 結語與展望

地貧是全球分布最廣、累計人數(shù)最多的一種單基因遺傳病，主要發(fā)生在地中海沿岸國家和東南亞各國。全世界每年約有34 萬名患有嚴重血紅蛋白病的兒童出生，其中90%在發(fā)展中國家和低收入國家，給國家?guī)砹司薮蟮墓残l(wèi)生負擔［33］。在我國，地中海貧血基因攜帶者高達3 000 萬人，中重型地中海貧血病患者達30 萬人，當前TDT 患者仍然有巨大的未被滿足的醫(yī)療需求［34］。經(jīng)過多年的研究，β-地中海貧血的治療新紀元已經(jīng)開始，β-地貧是非常理想的基因治療適應癥。針對不同的基因治療策略，必須在效率、功效和安全性方面進行比較，以便為β-地中海貧血患者提供最佳的治療選擇。