劉宇陽 藍鍇 熊蕊 魯洋 蔡依玫 向國秀 陳茶 黃彬★

大腸埃希菌（Escherichia coli，E.coli）是條件致病菌，常導(dǎo)致免疫低下人群感染［1］。2019年耐碳青霉烯類大腸埃希菌（carbapenem-resistantEscherichia coli，CREC）的全國平均分離率為1.7%，比2018年上升了0.2%。隨著多粘菌素耐藥基因mcr-1的檢出［2］，替加環(huán)素（tigecycline，TGC）被認為是治療CREC 的最后一道防線［3］。不幸的是，已有大量報道顯示細菌對TGC 耐藥，其主要耐藥機制是RND（resistance nodulation division，RND）外排泵系統(tǒng)的上調(diào)［4］。研究表明，大腸埃希菌中AcrAB受全局調(diào)控因子MarAB 的調(diào)控［5］，其外膜通透性受主要膜孔蛋白OmpC、OmpF 和OmpX 的調(diào)節(jié)［6］。異質(zhì)性耐藥（heteroresistance，HR）意指同一克隆菌株中同時存在對某種抗生素耐藥和敏感亞群的現(xiàn)象［7］。HR 的難檢出性常導(dǎo)致臨床治療失敗和感染復(fù)發(fā)。目前，耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌對TGC 異質(zhì)性耐藥已有報道［8］，但尚未見CREC-TGC-HR 的報道。本研究對檢測異質(zhì)性耐藥的方法進行比較，分析并探討CREC-TGC-HR的流行情況和耐藥機制，為臨床治療和合理應(yīng)用抗生素提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集2017年1月至2019年3月間廣州（中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院17 株、廣東省中醫(yī)院23 株）和寧夏（寧夏醫(yī)科大學(xué)寧夏總醫(yī)院18 株）兩個地區(qū)三個中心臨床分離的CREC，所有菌株均經(jīng)Vitek 2 全自動微生物鑒定系統(tǒng)鑒定。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，由廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院檢驗科微生物室保存。

1.2 主要儀器與試劑

TGC 粉末購自英國APE-BIO 公司，Mueller-Hinton（M-H）瓊脂或M-H 肉湯購自英國Oxoid 公司，Vitek 2 全自動微生物檢測系統(tǒng)購自法國生物梅里埃公司，RNA 提取試劑RNAiso Plus、qPCR 試劑盒SYBR Green qPCR Master Mi 和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT 均購自中國大連TaKaRa 公司。ViiA 7 Dx 熒光定量PCR 儀購自美國Applied Biosystems 公司，GBox 全自動凝膠成像儀購自美國Bio-Rad 公司。PCR 引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 改良E-test

參考Andersson 等的方法［7］：將菌液調(diào)至2.0 麥?zhǔn)蠞岫群?，均勻涂布于M-H 平板，貼相應(yīng)的E-test試紙條，37℃孵育48 h 后觀察結(jié)果。

1.4 異質(zhì)性耐藥表型初篩

采用菌群譜型分析微量滴定法（microtitration population analysis profiling，MPAP）［9］，配置2-4～24mg/L 共9 個倍比稀釋濃度含TGC 的M-H 平板。細菌接種于M-H 肉湯培養(yǎng)基，37℃過夜增菌后，用M-H 肉湯稀釋至101～107CFU/mL。取10 μL 菌液滴定于PAP 梯度抗生素平板，每克隆重復(fù)兩滴，實驗重復(fù)三次。37℃孵育48 h 后觀察細菌生長情況。若最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）與最高不抑菌濃度（the highest noninhibitory concentration，HNIC）的比值大于8，初篩為TGC-HR 陽性。對照菌株為非異質(zhì)性耐藥的大腸埃希菌ATCC 25922 和臨床分離的泛耐藥大腸埃希菌132A5（本實驗室分離的菌株）。

1.5 異質(zhì)性耐藥表型確認

采用菌群譜型分析法（population analysis profiling，PAP）［7］，配置2-4～24mg/L 共9 個倍比稀釋濃度含TGC 的M-H 平板。將HR 陽性菌株接種于M-H 肉湯培養(yǎng)基，37℃過夜增菌，梯度稀釋后，取20 μL 菌液均勻涂布于PAP 梯度抗生素平板，重復(fù)三次。37℃孵育48 h 后菌落計數(shù)，并使用Graph-Pad Prism 軟件將菌落數(shù)量與TGC 濃度作圖，若MIC 與HNIC 比值大于8，確認為HR 陽性。對照菌株為非異質(zhì)性耐藥的大腸埃希菌ATCC 25922和臨床分離的泛耐藥大腸埃希菌132A5（本實驗室分離的菌株）。

1.6 基因表達分析

基于PAP 試驗，收集CREC-TGC-HR 母菌和異質(zhì)性耐藥亞群各6 株，接種于M-H 肉湯培養(yǎng)基，37℃過夜增菌。用Trizol 法提取菌株的mRNA。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT 逆轉(zhuǎn)錄出cDNA。參照SYBR Green 試劑盒進行RT-qPCR，并通過相對定量法（2-ΔΔCt）計算各基因相對表達量。qPCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃30 s；變性95℃5 s，退火60℃34 s，共40 個循環(huán)；熔解曲線95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。所用的PCR 引物序列見表1。

表1 大腸埃希菌RT-qPCR 引物序列［10］Table 1 RT-qPCR primer sequence of E.coli［10］

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，并進行兩獨立樣本的t檢驗。計數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CREC 臨床和流行病學(xué)特征

本研究共收集到58 株CREC 中最常見的標(biāo)本類型是痰液20.7%（17/58）和尿液13.4%（11/58），其次是血液11%（9/58）和引流液9.8%（8/58）。科室分布主要是重癥監(jiān)護室（24.4%，20/58）、內(nèi)科（23.2%，19/58）和外科（18.8%，15/58）。根據(jù)Vitek 2 全自動微生物檢測系統(tǒng)的藥敏檢測結(jié)果，58 株CREC 中有兩株菌對TGC 耐藥，后續(xù)實驗中剔除這兩株菌（中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院和寧夏總醫(yī)院各1 株）。

2.2 HR 的初篩

對56株TGC敏感菌株進行HR初篩，改良E-test結(jié)果顯示，14 株CREC-TGC-HR 陽性（25.0%）。MPAP 結(jié)果顯示，22 株CREC-TGC-HR 陽性（39.3%），其中31.8%（7/22）來自中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，22.7%（5/22）來自寧夏總醫(yī)院，45.5%（10/22）來自廣東省中醫(yī)院。見圖1。

圖1 CREC-TGC-HR 的MPAP 結(jié)果Figure 1 The results of carbapenem-resistanct E.coli CRECHR to tigecycline by microtitration PAP method

2.3 HR 的確認

56 株TGC 敏感的CREC 中，有21 株表現(xiàn)為替加環(huán)素異質(zhì)性耐藥（CREC-TGC-HR），檢出率為37.5%（21/56）。中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院、廣東省中醫(yī)院和寧夏總醫(yī)院CREC-TGC-HR 的檢出率分別是43.8%（7/16）、43.5%（10/23）和23.5%（4/17），兩兩間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。從標(biāo)本種類分布來看，陽性菌株主要來源于痰液（47.6%，10/21）和尿液（19.0%，4/21）等體液標(biāo)本。從科室分布來看，陽性菌株主要來源于ICU（38.0%，8/21）、內(nèi)科（28.6%，6/21）和外科（19.0%，4/21）。見圖2。

圖2 CREC-TGC-HR 的PAP 結(jié)果Figure 2 Population analysis profiles（PAP）of TGC-HR in CREC

2.4 異質(zhì)性耐藥機制

與CREC-TGC-HR 原始菌株相比，CREC-TGCHR 耐藥亞群外排泵基因acrA、acrB表達上調(diào)1.79倍、5.01 倍；其相關(guān)調(diào)控基因marA、marB分別表達上調(diào)5.38 和2.18 倍；膜孔蛋白基因ompC下調(diào)2.35倍，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。膜孔蛋白基因ompF和ompX的表達比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 CREC-TGC-HR 原始菌株和耐藥亞群各基因mRNA相對表達量（±s）Table 2 Relative mRNA level of gene expression of native populations and HR-subpopulations in CREC-TGC-HR（±s）

表2 CREC-TGC-HR 原始菌株和耐藥亞群各基因mRNA相對表達量（±s）Table 2 Relative mRNA level of gene expression of native populations and HR-subpopulations in CREC-TGC-HR（±s）

基因acrA acrB marA marB ompC ompF ompX原始菌株1.094±0.104 0.977±0.103 1.020±0.060 1.283±0.248 1.465±0.421 0.913±0.118 1.175±0.364耐藥亞群1.955±0.158 4.860±0.221 5.494±0.313 2.789±0.378 0.617±0.152 0.621±0.203 0.834±0.133 P 值0.001 0.001 0.001 0.004 0.031 0.097 0.202

3 討論

自1997年首次報道甲氧西林異質(zhì)性耐藥金黃色葡萄球菌［11］以來，已在一些細菌中發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性耐藥現(xiàn)象，如肺炎克雷伯菌［12］、肺炎鏈球菌［13］、結(jié)核分枝桿菌［14］、鮑曼不動桿菌［15］、銅綠假單胞菌［16-17］和幽門螺桿菌［18］等臨床常見致病菌。目前，國內(nèi)也有少量關(guān)于CRE 異質(zhì)性耐藥的報道［19-20］，但其耐藥機制不夠明確。這些研究大多基于紙片擴散法（Kirby-Bauer，K-B 法）和E-test 法進行HR 初篩。研究發(fā)現(xiàn)，K-B 法和E-test 法均存在較高的假陰性率［9］，導(dǎo)致HR 的漏檢。本研究結(jié)果表明，改良E-test 法與PAP 的陽性檢出率相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示E-test 法篩查CREC-HR 存在較高的假陰性率。MPAP 法陽性檢與PAP 相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示MPAP 法是目前最接近HR檢測金標(biāo)準(zhǔn)PAP 法的檢測方法。MPAP 法既比K-B 法和E-test 法有更高的準(zhǔn)確度，又比PAP 節(jié)約檢測成本，操作更簡便。但是由于MPAP 采用微量滴定的方法，仍存在一定的假陽性率，僅作為HR 的初篩方法，其實驗結(jié)果需要用PAP 確認。

有文獻報道耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌對TGC的異質(zhì)性耐藥率為20.0%（28/140）［21］，銅綠假單胞菌對頭孢吡肟的異質(zhì)性耐藥率為57.3%（110/223）［17］，出現(xiàn)這種差異可能與抗生素種類、細菌種類以及地區(qū)差異等因素有關(guān)。雖然目前細菌對TGC 的耐藥率還處于較低水平，鑒于本研究中發(fā)現(xiàn)CREC 對TGC 較高水平的異質(zhì)性耐藥率，應(yīng)該高度重視關(guān)注這個問題。

據(jù)報道，大腸埃希菌TGC耐藥機制與RND家族AcrAB-TolC 有關(guān)，AcrAB 同時受外排泵調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中MarAB的調(diào)節(jié)；marA位點直接或間接增加了micF的表達，導(dǎo)致ompF的表達減少［22］。本研究結(jié)果提示RND 外排泵上調(diào)與替加環(huán)素異質(zhì)性耐藥顯著相關(guān)。

本研究中大部分CREC 分離自ICU，這部分患者大多數(shù)合并多種基礎(chǔ)性疾病，且病情復(fù)雜，免疫能力相對低下，加上用藥情況復(fù)雜，更容易感染CREC。大部分CREC 標(biāo)本來自痰液和尿液，可能與呼吸道和尿道感染有關(guān)。但由于本研究存在局限性，CREC 臨床標(biāo)本相對較少，因此，若要進行下一步危險因素分析，仍需擴大樣本量。

綜上所述，CREC 對TGC 有較高的異質(zhì)性耐藥率。CREC-TGC-HR 與RND 外排泵系統(tǒng)上調(diào)有關(guān)。采用有效的方法及時檢測HR 菌株，有助于臨床合理用藥，避免HR 菌株發(fā)展為耐藥菌，可縮短治療時間和減輕患者負擔(dān)。