張陽 王芳 房建成 王明宇 劉洪 徐雯 陳雪 曹泮翔 虞亞菲 馬小麗 李綿洋 劉紅星，3，4★

近年來，基因測序技術(shù)和腫瘤分子生物學(xué)研究飛速發(fā)展，很多的分子病因被鑒定，其中對臨床診斷/分類、預(yù)后分層及治療具有重要意義的基因異常已經(jīng)越來越多地被加入到血液腫瘤診療指南中［1-4］，分子指標(biāo)所占的比重越來越大。2018 版二代測序（Next generation sequencing，NGS）血液腫瘤應(yīng)用中國專家共識中，AML 中必要檢測的突變基因有17 種，建議檢測的突變基因有21 種［5］。2016年版世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）造血和淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)中所涉及的血液腫瘤相關(guān)體細(xì)胞突變基因就有100 多種［1］。因此，血液腫瘤的基因突變分析已不再局限于僅檢測少數(shù)幾個分子指標(biāo)，而是強(qiáng)調(diào)進(jìn)行“突變組”分析。但隨著檢測基因數(shù)目的增加，新加入基因的突變陽性率也在減低，基因突變篩查項目中所涵蓋的檢測基因數(shù)目及其可提供的臨床意義也存在爭議。本研究擬對比分析三種包含不同基因數(shù)目基因突變篩查的應(yīng)用，以評估其對急性髓性白血?。ˋcute myeloid leukemia，AML）患者臨床診療獲益的情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年6月至2019年5月期間就診于本院的721例AML 患者為研究對象，其中男409例，女312例，年齡1～75 歲，平均（25.44±18.68）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①AML 的診斷符合世界衛(wèi)生組織2016年版造血和淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)［1］；②初診未經(jīng)治療的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：治療相關(guān)AML 和繼發(fā)AML患者。本研究經(jīng)河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者或家屬均已簽署知情同意書。

1.2 基因組DNA 制備

收集患者初診時的骨髓或骨髓涂片標(biāo)本，新鮮骨髓標(biāo)本裂解紅細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，取1.0×107個有核細(xì)胞提取基因組DNA。骨髓涂片細(xì)胞用移液器和純水反復(fù)吹洗，用得到的細(xì)胞懸液提取基因組DNA.參照TGuide S32 血液基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司，貨號：No.DP601-T5C）說明書采用磁珠法提取基因組DNA。

1.3 基因突變檢測和分析

采用靶向擴(kuò)增子高通量基因測序方法（Ion Torrent PGM 測序儀，Thermo Fisher Scientific），分別檢測9 種、16 種和58 種突變基因，分析范圍包括基因編碼區(qū)全長或突變熱點(diǎn)區(qū)域。9 種篩查包括在AML 中具有明確診斷、預(yù)后或治療意義的9 種基因，即I 類突變［6］：ASXL1、CEBPA、FLT3、IDH1、IDH2、KIT、NPM1、RUNX1和TP53.16 種篩查在上述9 種突變基因的基礎(chǔ)上，增加7 種突變率較低但具有臨床意義的基因，包括DNMT3A、ETV6、KRAS、NRAS、PTPN11、PHF6和TET2.58 種篩查在上述16 種突變基因的基礎(chǔ)上，增加42 種突變率較低但在血液系統(tǒng)腫瘤中具有潛在臨床意義的基因［7］。變異過濾、識別及注釋分析流程參照河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院既往的研究報道［7］。

1.4 基因突變分類

依據(jù)WHO、美國綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）和歐洲白血病網(wǎng)絡(luò)（European Leukemia Net，ELN）發(fā)布的AML診療指南、專家共識及近年來權(quán)威的研究報道［1-3，5］，將基因突變根據(jù)臨床意義進(jìn)行分類：①診斷/鑒別診斷意義：CEBPA雙突變（double-mutatedCEBPA，CEBPAdm）、NPM1、JAK2 V617F、CALR、MPL、CSF3R、CBL、SETBP1、SF3B1、SRSF2、U2AF1和ZRSR2。②預(yù)后分層意義：CEBPAdm、NPM1、KIT、RUNX1、FLT3-ITD、WT1、ASXL1和TP53。③靶向/潛在靶向治療意義：FLT3-ITD/TKD、KIT、CSF3R、JAK1、JAK2、JAK3、IDH1、IDH2和BRAF。④化療/非靶向治療意義：DNMT3A、TET2、EZH2、KRAS、NRAS和PTPN11。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因突變陽性率

檢測9 種、16 種和58 種基因時，分別有66.2%、79.6%和86.4%的患者突變陽性（圖1），23.2%、39.4%和56.3%的患者攜帶兩種及以上基因突變。檢測58 種基因的突變陽性率顯著高于9 種（χ2=81.71，P＜0.001）和16 種（χ2=12.25，P＜0.001），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。檢測9 種基因時，突變率最高的三種基因為FLT3-ITD（20.9%）、CEBPA（16.5%）和KIT（14.0%）。檢測16 種和58 種基因時，突變率最高的三種基因均為FLT3-ITD（20.9%）、NRAS（17.3%）和CEBPA（16.5%）。

圖1 9 種，16 種和58 種基因的突變陽性率Figure 1 The positive rates of 9，16，and 58 mutated genes were tested

2.2 基因突變個數(shù)

檢測9 種基因時，最多檢測到有患者同時攜帶4 種基因突變，突變陽性的患者中攜帶1 種和多種（≥2 種）基因突變患者的比例分別為65.0%和35.0%（圖2A）。檢測16 種基因時，最多檢測到有患者同時攜帶6 種基因突變，攜帶1 種和多種（≥2種）基因突變患者的比例分別為50.4%和49.6%。（圖2B）檢測58 種基因時，最多檢測到有患者同時攜帶6 種突變，攜帶1 種和多種（≥2 種）基因突變患者的比例分別為34.8%和65.2%（圖2C）。檢測58 種基因時，只攜帶1 種基因突變患者的比例顯著低于檢測9 種（χ2=98.46，P＜0.001）和16 種基因（χ2=29.78，P＜0.001），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而攜帶多種（≥2 種）基因突變患者的比例顯著高于檢測9種（χ2=98.46，P＜0.001）和16 種（χ2=29.78，P＜0.001）基因，尤其是攜帶3 種、4 種或5 種基因突變的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 攜帶不同突變個數(shù)患者的比例Figure 2 The proportion of patients with a different number of mutations

2.3 基因突變組合

檢測9 種、16 種和58 種基因時，分別檢出66種、186 種和329 種不同的突變組合，所揭示的腫瘤克隆異質(zhì)性顯著增加（圖3）。單種基因突變中突變率最高的基因均為KIT（9 種：10.1%；16 種：8.3%；58 種：5.7%）；最常見的2 種基因突變的組合為分別為NPM1+FLT3-ITD（9 種：2.9%）、CEBPAdm+NRAS（16 種：1.7%）和CEBPAdm+GATA2（58 種：1.4%）；最常見的3 種基因突變的組合均為NPM1+IDH1/IDH2+FLT3-ITD（9 種：2.1%；16 種：1.7%；58 種：1.2%）。

圖3 檢測9 種，16 種和58 種突變基因患者的克隆異質(zhì)性Figure 3 The clonal heterogeneity of patients in the testing of 9，16，and 58 genes

2.4 基因突變的臨床獲益分析

檢測9 種、16 種和58 種基因，能分別為25.9%、25.9%和35.9%的患者提供輔助診斷/疾病分類相關(guān)的信息；為59.5%、60.6%和64.2%的患者提供預(yù)后分層相關(guān)的信息；為44.1%、44.7%和50.2%的患者提供靶向/潛在靶向治療相關(guān)的信息；為0.0%、35.1%和38.1%的患者提供化療/非靶向治療相關(guān)的信息；為39.4%、35.5%、34.1%的患者同時提供兩種臨床指導(dǎo)信息；為12.8%、23.2%、31.3%的患者同時提供至少三種臨床指導(dǎo)信息。

在9 種基因的基礎(chǔ)上增加檢測7 種基因，可為39.6%（97/244）的9 種基因突變陰性的患者提供診療輔助信息，為36.9%（176/477）的9 種基因突變陽性的患者提供更多的診療輔助信息。而在16 種基因的基礎(chǔ)上增加檢測42 種基因，可為33.3%（49/147）的16 種基因突變陰性的患者提供診療輔助信息，為39.0%（224/574）的16 種基因突變陽性的患者提供更多的診療輔助信息。相比于只檢測9種、16 種基因指標(biāo)，檢測58 種基因總體上能為總計62.4%（450/721）、37.9%（273/721）的患者提供臨床診療和預(yù)后信息。見圖4。

3 討論

腫瘤分子生物學(xué)的快速進(jìn)展和測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，為血液腫瘤患者篩查更多突變基因提供了知識基礎(chǔ)和技術(shù)條件。目前對單個或多個突變基因臨床及生物學(xué)意義探討的研究報道有很多，但對于基因突變檢測的醫(yī)學(xué)經(jīng)濟(jì)學(xué)問題缺乏相關(guān)的數(shù)據(jù)和討論。

圖4 檢測9 種，16 種和58 種突變基因患者的臨床獲益情況Figure 4 The clinical benefits for patients in the testing of 9，16，and 58 genes

本研究基于高通量基因測序技術(shù)，對比分析了分別檢測9 種、16 種和58 種基因時的突變和臨床獲益情況。結(jié)果表明，隨著檢測基因指標(biāo)的增加，總的突變陽性率、平均患者攜帶突變的數(shù)目及組合均顯著增加，僅檢測58 種基因就能為86.4%的患者提供有效的突變信息。Papaemmanuil E 等報道，當(dāng)增加到檢測111 種時，96%的AML 患者突變陽性［7］。因此，進(jìn)行全面的基因突變篩查，有助于更加深入和全面的評估病情。但是，在轉(zhuǎn)化為臨床檢測時，并非所有的突變基因都具有臨床意義或方便檢測，檢測成本也是必須要考慮的因素。因此，最終分析目標(biāo)基因的選擇必然是綜合考量的結(jié)果。

AML 是一組高度克隆異質(zhì)性的疾病，雖然目前根據(jù)遺傳學(xué)危險度分層總體上分為預(yù)后良好、中等和差［3］，但仍是較為粗略和籠統(tǒng)的劃分。本研究對721例患者僅檢測58 種基因，就有多達(dá)329種突變組合，平均每2 個人的突變組合都不相同。不同患者間顯著的克隆異質(zhì)性，可能是臨床治療及預(yù)后存在差異的重要因素。對基因突變的全面和深入分析，才能幫助做到真正意義上的精確分層和個體化治療。

不同的基因突變可具有單方面或多方面的臨床意義，如NPM1同時具有診斷分型和預(yù)后判斷的意義，F(xiàn)LT3-ITD突變同時具有預(yù)后判斷和靶向治療的意義。近些年，隨著FLT3激酶抑制劑［8］、IDH1/2抑制劑等靶向治療研究的快速進(jìn)展，為攜帶這些基因突變的患者提供了更多的治療選擇。其次，基因突變對特定化療藥物的反應(yīng)也具有提示意義，如伴RAS突變的AML 患者常會獲益于緩解后大劑量阿糖胞苷治療［9］，DNMT3A突變會通過影響核小體重塑而促使AML 患者對蒽環(huán)類藥物耐藥［10］。此外，不同的突變組合也具有一定的臨床意義，如DNMT3A、NPM1和FLT3-ITD突變同時伴隨出現(xiàn)提示預(yù)后很差［11-12］。全面了解突變組合的規(guī)律，未來能幫助更加深入的理解其致病機(jī)制及輔助臨床診療。

基于檢測成本的考慮，部分突變發(fā)生率較低（＜5%）基因的檢測價值常常受到質(zhì)疑。事實上，在AML 及很多其他惡性腫瘤中，基因突變的發(fā)生呈現(xiàn)長尾現(xiàn)象［11-13］，即一些少見基因的突變率較低，但種類多，累加起來的總體陽性率并不低。Maxson JE 等和本院前期的研究，發(fā)現(xiàn)約4%～5%的初診AML 患者攜帶CSF3R突變［6，14］，約5%的ALL 患者攜帶FLT3突變［15］。這些結(jié)果的發(fā)現(xiàn)得益于全面的基因突變篩查，而不是只檢測少數(shù)幾種基因指標(biāo)。因此，全面的篩查有助于發(fā)現(xiàn)這些少見突變基因的致病規(guī)律，并提供潛在的治療靶點(diǎn)。

就目前來說，受限于檢測成本和分析能力，進(jìn)行幾十種或上百種突變基因的檢測是最為有效的篩查方式。但隨著基因組檢測成本和周期的快速下降、數(shù)據(jù)分析能力的提高，在不久的將來，全外顯子組測序、全基因組測序、全轉(zhuǎn)錄組測序?qū)⑹歉尤娴暮Y查方式，將為醫(yī)學(xué)檢驗帶來從“目標(biāo)檢測”到“目標(biāo)分析”的革新性進(jìn)展［16］，更進(jìn)一步提高我們對疾病的認(rèn)知，從而更好地輔助臨床診療。