楊 璇 劉小鵬 彭 宇 甄 然 宋彬彬 李 闊 于 佳

富亮氨酸重復(fù)激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)突變是PD最為常見的遺傳因素，LRRK2突變所致的PD發(fā)病年齡晚，在臨床表現(xiàn)上與特發(fā)性PD更為接近[1]。因此，對(duì)LRRK2生理病理功能機(jī)制的解釋對(duì)于闡釋帕金森病發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。LRRK2表達(dá)異常可導(dǎo)致小鼠運(yùn)動(dòng)功能障礙，但是其中的具體機(jī)制目前仍不明確[2]。本實(shí)驗(yàn)將利用LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S突變基因敲入小鼠和R1441C突變基因敲入小鼠，明確LRRK2的表達(dá)或功能異常對(duì)紋狀體神經(jīng)元多巴胺受體1(dopamine receptor 1，D1R)含量的影響，并探討LRRK2調(diào)節(jié)紋狀體神經(jīng)元中D1R的機(jī)制，為豐富人們對(duì)LRRK2參與帕金森病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S突變基因敲入小鼠和R1441C突變基因敲入小鼠及野生型對(duì)照組，飼養(yǎng)在美國國立衛(wèi)生院老年病研究所，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)管理規(guī)定進(jìn)行操作和處理[3～5]。

2.主要試劑：大鼠單克隆D1R抗體購自美國Sigma公司，兔單克隆抗體NeuN購自英國Abcam公司，山羊多克隆組織蛋白酶D(cathepsin D)抗體購自美國R&D Systems公司，驢血清購自美國Jackson Immuno Research公司，牛血清白蛋白購自美國Sigma公司，熒光二抗、抗熒光淬滅封片劑(含DAPI)購自美國Invitrogen公司。

3.免疫熒光染色：小鼠進(jìn)行腹腔麻醉，沿胸旁正中線切開皮膚、剪斷肋骨、暴露心臟。在心尖處剪開左心室，插入灌流針至左心室，剪開右心耳。先用PBS灌流，沖凈血液后用4%多聚甲醛固定液灌流。取腦后繼續(xù)固定過夜，再放入30%蔗糖溶液中進(jìn)行脫水。沿鼠腦冠狀面做冰凍切片，厚度為40μm，將切片浸泡于PBS置于4℃保存。配制PBST(含0.3% Triton X-100)緩沖液，用封閉液(含10%驢血清和1%牛血清白蛋白的PBST)孵育腦片1h，然后4℃一抗孵育過夜，清洗3遍；熒光二抗室溫下孵育腦片1h，PBS清洗3遍。將腦片鋪展于載玻片上，并用抗熒光淬滅封片劑(含DAPI)封片，晾干后，在激光共聚焦顯微鏡(LSM 800，德國Zeiss公司)下觀察拍照。

結(jié) 果

LRRK2基因敲除或G2019S和R1441突變導(dǎo)致紋狀體中多巴胺受體D1R含量下降(圖1)。本實(shí)驗(yàn)利用LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠，應(yīng)用免疫熒光染色的方法檢測了12月齡小鼠紋狀體中D1R表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠紋狀體中D1R熒光強(qiáng)度均顯著下降。

LRRK2通過調(diào)節(jié)溶酶體影響紋狀體神經(jīng)元多巴胺受體D1R含量(圖2)。筆者利用cathepsin D免疫熒光染色標(biāo)記溶酶體。觀察發(fā)現(xiàn)，在12月齡野生型小鼠紋狀體神經(jīng)元內(nèi)cathepsin D陽性的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)數(shù)目較少，而在12月齡LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠紋狀體神經(jīng)元內(nèi)cathepsin D陽性點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)數(shù)目顯著增加，在LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠紋狀體神經(jīng)元內(nèi)cathepsin D陽性點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)直徑增大。且經(jīng)定量分析，在LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠紋狀體神經(jīng)元內(nèi)溶酶體所占據(jù)的總面積顯著增加。同時(shí)筆者還發(fā)現(xiàn)，在野生型小鼠、LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠紋狀體神經(jīng)元中cathepsin D與D1R共定位，也就表明在LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠紋狀體神經(jīng)元溶酶體中D1R增加。

圖2 12月齡野生型、LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠紋狀體神經(jīng)元中D1R和溶酶體標(biāo)志物cathepsin D共定位情況

討 論

目前已經(jīng)證實(shí)了超過40個(gè)與PD發(fā)病相關(guān)的LRRK2突變，目前研究最多的突變位點(diǎn)有9個(gè)，分別是位于ROC結(jié)構(gòu)域的R1441C、R1441G、R1441H、R1514Q突變[6]。位于COR結(jié)構(gòu)域的Y1699C突變，位于激酶結(jié)構(gòu)域的I2012T、G2019S突變以及位于WD40結(jié)構(gòu)域的G2385R突變[7，8]。

研究者建立了多個(gè)LRRK2轉(zhuǎn)基因小鼠模型以研究LRRK2在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能。Melrose等[9]建立了過表達(dá)野生型LRRK2或G2019S突變的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，并利用HPLC法檢測發(fā)現(xiàn)野生型或G2019S轉(zhuǎn)基因小鼠紋狀體內(nèi)多巴胺含量與非轉(zhuǎn)基因小鼠比較無明顯的改變，但是利用微透析法檢測發(fā)現(xiàn)野生型或G2019S轉(zhuǎn)基因小鼠紋狀體細(xì)胞外多巴胺含量明顯降低。Chen等[10]研究發(fā)現(xiàn)，12～16月齡的G2019S轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)為明顯的運(yùn)動(dòng)障礙，而L-DOPA能夠有效地改善該運(yùn)動(dòng)障礙。Maekawa等[11]利用HPLC法檢測到在10周齡的I2020T突變轉(zhuǎn)基因小鼠紋狀體內(nèi)多巴胺以及其代謝物DOPAC和HVA的含量均顯著下降，且變現(xiàn)為明顯的運(yùn)動(dòng)功能障礙。以上證據(jù)表明，LRRK2與多巴胺神經(jīng)傳遞以及小鼠神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能密切相關(guān)。

多巴胺受體D1R與帕金森病的關(guān)系已被人們廣泛研究。多巴胺與多巴胺受體D1R結(jié)合，誘發(fā)胞內(nèi)信號(hào)通路發(fā)生改變，從而介導(dǎo)多巴胺調(diào)控的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能[12]。其中最為經(jīng)典的就是cAMP/PKA信號(hào)通路。D1R通過和Gαs偶聯(lián)激活腺苷酸環(huán)化酶，促使細(xì)胞內(nèi)cAMP合成增加，從而激活PKA并磷酸化多個(gè)底物蛋白。PKA能夠?qū)е露鄠€(gè)離子通道蛋白磷酸化狀態(tài)發(fā)生改變，如AMPA、GABAA、NMDA以及L、N和P型鈣離子通道，影響谷氨酸以及GABA等神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，從而調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)功能[13]。

Rassu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)野生型和突變型(G2019S和R1441C)LRRK2的SH-SY5Y細(xì)胞膜上的D1R含量明顯升高。但這一實(shí)驗(yàn)主要是在細(xì)胞系中進(jìn)行，且僅檢測了外源性D1R含量的改變，而未檢測小鼠腦內(nèi)D1R含量。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者檢測發(fā)現(xiàn)LRRK2表達(dá)缺失或G2019S和R1441突變均可導(dǎo)致紋狀體中多巴胺受體D1R含量下調(diào)，據(jù)此可以推斷LRRK2可調(diào)節(jié)紋狀體神經(jīng)元中D1R的含量。而LRRK2是通過何種細(xì)胞生物通路影響D1R的含量這一科學(xué)問題尚未明確。有研究表明，LRRK2可以通過調(diào)節(jié)Rab7的活性影響次級(jí)內(nèi)體的功能，進(jìn)而影響細(xì)胞降解功能[15]。

本研究中筆者利用cathepsin D免疫熒光染色標(biāo)記溶酶體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12月齡LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠紋狀體神經(jīng)元內(nèi)溶酶體數(shù)目均顯著增加，在LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠紋狀體神經(jīng)元內(nèi)溶酶體直徑增大。且經(jīng)定量分析，在LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠紋狀體神經(jīng)元內(nèi)溶酶體所占據(jù)的總面積顯著增加，這一結(jié)果表明LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠紋狀體神經(jīng)元內(nèi)的蛋白降解過程顯著增強(qiáng)。同時(shí)，LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠紋狀體神經(jīng)元內(nèi)與cathepsin D共定位的D1R也顯著增加，表明在LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠紋狀體神經(jīng)元內(nèi)發(fā)生降解的D1R增加。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LRRK2表達(dá)缺失或LRRK2 G2019S和R1441C突變均導(dǎo)致小鼠紋狀體中D1R含量下降，明確了LRRK2表達(dá)缺失或基因突變所致功能異常可以影響紋狀體中D1R的含量。LRRK2表達(dá)缺失、LRRK2 G2019S和R1441C突變可能通過促進(jìn)小鼠紋狀體神經(jīng)元蛋白降解，促使進(jìn)入溶酶體的D1R增加，D1R降解加強(qiáng)，從而使得紋狀體神經(jīng)元D1R含量下降。本研究結(jié)果有利于人們深入理解LRRK2的病理生理功能，并為LRRK2參與的帕金森病病理過程提供潛在的干預(yù)靶點(diǎn)。