楊國建，李 敏，2

(1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院兒科，四川 成都 610072)

支氣管哮喘是多種細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的慢性疾病。其發(fā)病機制十分復(fù)雜，Th1輔助細(xì)胞(Th1)和Th2輔助細(xì)胞(Th2)的亞群失衡、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)和TH17輔助細(xì)胞(Th17)的亞群失衡，致Th2表達亢進，分泌大量的Th2 型細(xì)胞因子(IL-4、IL-5 和 IL-13)引起氣道炎癥而導(dǎo)致相應(yīng)的病理變化；近年來研究發(fā)現(xiàn)，1，25二羥維生素D3[1，25-(OH)2-D3]、2型固有淋巴細(xì)胞等在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用[1]。本實驗通過1，25-(OH)2-D3干預(yù)后哮喘小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)是否改善，以及肺組織中C3 肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)、白細(xì)胞介素-33(interleukin，IL-33)和2型固有淋巴細(xì)胞(type 2 innate lymphocytes，ILC2)的表達變化，判斷1，25-(OH)2-D3對哮喘小鼠的Rac1，IL-33及ILC2有無影響?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料小鼠由成都達碩實驗動物有限公司提供。所有動物均飼養(yǎng)于四川省人民醫(yī)院動物實驗室。2019年4月，選取7 周齡SPF級BALB/c雌性小鼠30只，體重(22.3±1.5)g，采用隨機數(shù)字表法分為對照組、哮喘組和干預(yù)組，每組10只。

1.2 方法

1.2.1造模及實驗干預(yù) 參照經(jīng)典哮喘小鼠建模方法[2，3]略加修改。在實驗第1、8和15天，將致敏液0.2 ml(含100 μg，氫氧化鋁2 mg)分別腹腔注射至哮喘組和干預(yù)組小鼠；從第22天開始，每天用1% 雞卵蛋白與生理鹽水的混合溶液2 ml(含雞卵蛋白20 mg)霧化吸入30分鐘，連續(xù)14天以構(gòu)建哮喘模型，干預(yù)組于霧化前半小時腹腔注射1，25-(OH)2-D3液0.08 ml(含1，25-(OH)2-D3 0.08 μg)，每天1次，共14次，哮喘組給予生理鹽水等量代替。對照組則使用等量生理鹽水替代致敏液、1% 雞卵蛋白和1，25-(OH)2-D3行腹腔注射和霧化。霧化結(jié)束當(dāng)天對各組小鼠采取斷頭處理，取相同部位肺組織進行相關(guān)檢測。

1.2.2肺組織標(biāo)本HE染色 取小鼠部份左肺組織制備病理切片后行HE染色，在普通光鏡下觀察氣道組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3蛋白免疫印跡法檢測Rac1和IL-33的蛋白定量 取左肺組織，充分剪碎研磨得到組織懸液，用蛋白免疫印跡法檢測Rac1和IL-33蛋白表達水平

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測ILC2細(xì)胞數(shù)目 將小鼠右肺組織經(jīng)物理研磨和過濾后，離心分離，制備單細(xì)胞混懸液，取約1×106細(xì)胞于1.5 ml EP管中，加入ILC2抗體孵育，上機檢測ILC2細(xì)胞數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。使用直線相關(guān)分析判定Rac1、IL-33和ILC2之間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)及病理形態(tài)變化霧化后哮喘組小鼠出現(xiàn)煩躁、在籠內(nèi)來回走動、毛發(fā)豎起、點頭呼吸、呼吸加快加深、前肢縮抬、二便失禁等癥狀。干預(yù)組的上述表現(xiàn)在程度和持續(xù)時間上明顯減少。對照組僅在注射生理鹽水5 min內(nèi)出現(xiàn)煩躁不安，但無其他表現(xiàn)，并很快恢復(fù)正常。小鼠氣道組織病理形態(tài)學(xué)變化HE染色圖見圖1所示，哮喘組小鼠氣道壁充嚴(yán)重充血及伴有水腫，管腔狹窄且肺泡腔縮??；對照組支氣管壁光滑完整，上皮細(xì)胞排列整齊；干預(yù)組氣道壁光滑，管腔狹窄且肺泡腔縮小減輕明顯。證實小鼠哮喘模型構(gòu)建成功。

圖1 小鼠氣道組織HE染色圖(×400) a:對照組；b:哮喘組；c:干預(yù)組

2.2 三組小鼠Rac1和IL-33比較哮喘組和干預(yù)組的Rac1值較對照組明顯降低，但用1，25-(OH)2-D3干預(yù)后的干預(yù)組Rac1增加，仍低于對照組；哮喘組和干預(yù)組的IL-33值較對照組明顯增加，但用1，25-(OH)2-D3干預(yù)后的干預(yù)組IL-33較哮喘組有降低，仍高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1和圖2。

表1 三組小鼠Rac1和IL-33比較

圖2 三組Rac1和IL-33比較

2.3 三組小鼠ILC2計數(shù)結(jié)果分析如表2和圖3所示，哮喘組和干預(yù)組的ILC2的數(shù)量較對照組明顯增加。但經(jīng)1，25-(OH)2-D3干預(yù)后的干預(yù)組ILC2數(shù)量明顯降低，仍高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 三組小鼠ILC2計數(shù)比較 (104/ml)

圖3 三組ILC2計數(shù)結(jié)果

2.4 Rac1、IL-33、ILC2之間的相關(guān)性分析三組小鼠中，Rac1和IL-33之間、Rac1和ILC2之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.954、r=-0.957，P<0.05)；IL-33和ILC2之間為正相關(guān)關(guān)系(r=0.984，P<0.05)。

3 討論

ILC2是一類不同于 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞的淋巴細(xì)胞。在受到外來抗原，如病毒以及其他微生物或寄生蟲刺激時，氣道組織中多種細(xì)胞包括上皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生IL-33，IL-33進一步可激活I(lǐng)LC2使其呈活化狀態(tài)，活化的ILC2一方面可促進 Th2 細(xì)胞的增殖，維持哮喘機體的 Th2 極化狀態(tài)[4]，另一方面分泌大量的Th2 型細(xì)胞因子IL-5、IL-9和IL-13，引起氣道內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和聚集、杯狀細(xì)胞分化和粘液產(chǎn)生、上皮細(xì)胞過度增生、氣道平滑肌收縮和氣道纖維化，最終導(dǎo)致支氣管高反應(yīng)。Rac1是一種小GTP酶，在氣道上皮細(xì)胞吞噬清除凋亡細(xì)胞和抗炎癥環(huán)境形成的過程中起著不可或缺的作用。Rac1的表達能夠加強吞噬活性或吞噬途徑的抗炎癥功能。已有實驗研究表明，用OVA(雞卵蛋白)或 HDM(屋塵螨)作為抗原誘導(dǎo)和激發(fā)的小鼠哮喘模型中，在小鼠的支氣管上皮細(xì)胞中選擇性地刪除 Rac1，會導(dǎo)致上皮細(xì)胞吞噬凋亡細(xì)胞的清除能力障礙，使 Th2 免疫應(yīng)答增強和哮喘炎癥加重[5，6]。另有研究表明，哮喘小鼠的氣道上皮細(xì)胞中Rac1的表達水平明顯低于正常小鼠；將正常小鼠氣道上皮細(xì)胞中Rac1選擇性刪除后，在外來抗原刺激時，IL-33 的表達水平會顯著增加，并大量激活I(lǐng)LC2[7～9]。本研究發(fā)現(xiàn)哮喘組較對照組Rac1顯著下降，IL-33水平增高，ILC2 數(shù)目顯著升高，且Rac1與IL-33、ILC2都呈明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。而IL-33和ILC2呈明顯的正相關(guān)性，證實哮喘小鼠確實存在Rac1-IL33-ILC2通路的免疫變化。

1，25-(OH)2-D3能抑制成纖維細(xì)胞的功能，抑制平滑肌細(xì)胞的增值，通過調(diào)節(jié)氣道平滑肌相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，使氣道重塑和炎癥反應(yīng)減輕[10，11]。研究表明，1，25-(OH)2-D3能減少呼吸道上皮細(xì)胞 IL-33 的表達[12]，抑制ILC2活化[13]，但1，25-(OH)2-D3對氣道上皮細(xì)胞中Rac1的作用未知。本研究在成功建立哮喘模型后發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用1，25-(OH)2-D3進行干預(yù)的干預(yù)組其氣道炎癥明顯減輕；并且IL-33及ILC2的數(shù)目均較哮喘組顯著下降，Rac1顯著上升。因此推測，1，25-(OH)2-D3可能通過上調(diào)哮喘小鼠 Rac1 的表達水平，抑制IL-33的產(chǎn)生，使之水平降低，進而抑制ILC2的活化，減輕哮喘氣道炎癥，從根本上控制哮喘的發(fā)生和發(fā)展。

綜上，1，25-(OH)2-D3可通過調(diào)節(jié)哮喘小鼠的部份免疫變化來改善氣道炎癥，希望在未來能進一步研究該機制，為1，25-(OH)2-D3治療哮喘提供更多依據(jù)。