王繼雪，楊稀瑞，呂勃川，張百亮，趙 鋼

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱150040）

下肢動脈硬化閉塞癥（arteriosclerosis obliterans，ASO）是一種下肢缺血性疾病，主要為下肢動脈發(fā)生粥樣硬化性的病理改變，導致動脈逐漸狹窄、閉塞［1］。由于閉塞的管腔無法向患側(cè)肢體供應血液，可引起間歇性跛行、患側(cè)肢體疼痛，嚴重者甚至可引起潰瘍、壞死等［2］。據(jù)統(tǒng)計，75歲以上人群中ASO 的發(fā)病率高達15%～20%，普通人群發(fā)病率為3%～10%，以老年男性患者居多，給患者帶來極大痛苦的同時也給家庭及社會帶來巨大負擔［3］。越來越多的研究證實，炎性反應貫穿ASO 的全過程并在其中扮演重要角色，血管平滑肌細胞的過度增殖是促進動脈粥樣硬化斑塊形成，加劇動脈粥樣硬化進程的主要因素［4］。

本病屬于中醫(yī)“脫疽”范疇，早在華佗《神醫(yī)秘傳》中記載……“內(nèi)服藥用金銀花三兩，元參三兩，當歸二兩，甘草一兩，水煎服”。清·鮑相敖《驗方新編》中將本方命名為四妙勇安湯，此即后世治療脫疽養(yǎng)陰活血通絡之名方，并在臨床上均取得了較好的療效［5-7］?，F(xiàn)有的實驗研究多基于單通路或單靶點對四妙勇安湯治療ASO 的機制進行了研究，然而未能充分體現(xiàn)中藥及復方多成分、多靶點、多通路的作用特點［8-10］。因此，本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法對四妙勇安湯治療ASO 的潛在機制進行生物信息學預測，并以細胞實驗進行驗證，為今后中醫(yī)藥在治療ASO的實驗研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 四妙勇安湯主要活性成分篩選

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫，依次以“當歸”、“金銀花”、“玄參”、“甘草”作為檢索詞，篩選四妙勇安湯所含中藥的活性成分。以化合物活性成分OB≥30%及DL≥0.18作為篩選條件，收集各中藥有效活性成分靶點。

1.2 藥?病靶點網(wǎng)絡的構建

通過GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫以“Arteriosclero?sis occlusion”作為檢索詞，分別下載與ASO 相關靶點。并將1.1中所得到的藥物靶點與ASO靶點進行交互處理，即藥-病靶點，并藥-病靶點通過Cytoscape 軟件進行網(wǎng)絡藥理學可視化分析。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡的構建

將藥-病靶點上傳至String 數(shù)據(jù)平臺進行蛋白互作（protein protein interactio，PPI）網(wǎng)絡。以“Homo sa?piens”進行限定，互動得分為0.400。基于Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡進行網(wǎng)絡藥理學可視化分析。

1.4 GO和KEGG富集分析

將藥-病靶點輸入于DAVID 功能分析數(shù)據(jù)平臺，進行基因本體論（gene ontology，GO）分析及京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，以“Homo sapiens”作為限定。通過OmicShare 及Cytoscape 軟件對GO 及KEGG功能富集分析進行網(wǎng)絡藥理學可視化分析。

1.5 動物及細胞

24只SPF級健康SD 大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：SCXK（京）：2016-0006。各組大鼠均采取單獨飼養(yǎng)，自由飲食水。大鼠血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells，VSMCs）購自中國科學院典型細胞培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。實驗過程嚴格按照動物倫理及福利相關要求進行。

1.6 藥品及試劑

四妙勇安湯（組成：金銀花、玄參各50 g、當歸30 g、生甘草50 g），由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院藥劑科提供，蒸餾水浸泡60 min，文火反復煎煮2 次，取汁備用，并以紗布反復濾過2次，以80℃水浴制備含量為每1 mL 含生藥1 g 的混懸液藥汁，以無菌玻璃瓶密封，4℃冰箱備用儲存。阿托伐他汀片（20 mg/片，國藥準字：J20120050）購于輝瑞制藥有限公司；ox-LDL 購自廣州奕元生物生物技術有限公司；IL-1β、IL-6 試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BrdU、CCK8 試劑盒、GAPDH 兔抗鼠單克隆抗體Triton X-100、First Strand cDNA Synthesis Kit、Real Time PCR Kit、購自上海碧云天生物科技有限公司。PBS 磷酸鹽緩沖液購自美國Sunbio公司。

1.7 含物血清制備

健康SD 大鼠24 只，隨機分為4 組，每組6 只。按正常成人用藥劑量，根據(jù)人和大鼠體表面積折算等效劑量［11］，高劑量組給予中藥湯劑4 g?kg-1?d-1灌胃，中劑量組給予中藥湯劑3 g?kg-1?d-1，低劑量組給予中藥湯劑2 g?kg-1?d-1灌胃，1.5 mL/次，每日1次灌胃?？瞻捉M予等量生理鹽水，阿托伐他汀對照組予以3 μmol/L進行干預。連續(xù)灌胃7 d，末次灌胃2 h后，予1%戊巴比妥鈉進行腹腔注射麻醉，無菌條件下于腹主動脈采血，靜置4 h，以3 000 r/min，4℃下進行15 min 離心，分離血清，0.22 μm 濾膜過濾，56℃水浴滅菌，30 min 滅活，?20℃情況下備用。

1.8 細胞培養(yǎng)及實驗分組

VSMCs 用DMEM 培養(yǎng)基于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。并取對數(shù)期生長的細胞以6×104/孔接種于100 mm 培養(yǎng)皿中，將純化培養(yǎng)48 h 的VSMCs隨機分為6組，分為空白組，模型組，低、中、高劑量中藥血清干預組和阿托伐他汀干預組。空白培養(yǎng)組用稀釋后的不含藥的大鼠血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h。模型組，低、中、高劑量中藥血清干預組和阿托伐他汀干預組經(jīng)ox-LDL作用24 h后，分別加入使用VSMCs維持培養(yǎng)液稀釋10倍的不含藥的大鼠血清，低、中、高劑量中藥血清和阿托伐他汀母液培養(yǎng)24 h。各組均設置6個孔，置于37℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后用于檢測。

1.9 檢測指標

1.9.1 倒置顯微鏡觀察各組細胞形態(tài) 取生長穩(wěn)定濃度為1×106個/mL 的VSMCs 0.5 mL，PBS 緩沖液漂洗兩遍，加入1～1.5 mL的消化液消化、離心后接種于培養(yǎng)皿，分為空白組、模型組、四妙勇安低、中、高劑量組、西藥組，于37℃、5%CO2條件下的培養(yǎng)箱進行同化處理，依次加入15% 0.15 mL 的含藥血清和1×10-6mol/L 的阿托伐他汀，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h 后，于倒置顯微鏡下觀察比較細胞形態(tài)變化。

1.9.2 CCK8 及BrdU 法實驗檢測VSMCs 增殖水平 采用CCK8試劑盒，于接種后的第24、48、72 小時分別檢測各組VSMCs 的增殖，參照CCK8 試劑盒說明進行操作，ELISA 檢測儀測定各孔450 nm 處OD數(shù)值。

將VSMCs接種于6孔板中，每孔1.5×105個，待細胞貼壁后行同步化處理。各組細胞干預48 h后，于各孔內(nèi)加入BrdU 液20 μL，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，室溫下加4 %多聚甲醛固定15 min，并予0.1% Triton X-100進行洗滌，5%脫脂奶粉封閉1 h，加BrdU 抗體，置于4 ℃下孵育過夜，紅色熒光標記羊抗鼠二抗，室溫下孵育1 h，予甘油封片，熒光顯微鏡下觀察各組BrdU陽性細胞數(shù)。

1.9.3 ELISA 法 檢 測IL?6、IL?1β 表 達 水 平 取VSMCs加入緩沖液，3 000 r/min，離心10 min，提取上清，并按IL-1β、IL-6 ELISA 試劑盒說明書方法，對濃度已達到均衡的VSMCs 中IL-1β、IL-6 的含量進行檢測。

1.9.4 RT?PCR 檢測PCNA、JAK2、STAT3 mRNA表達水平 采用TRlzol 法提取總RNA，采用核酸檢測儀檢測其濃度，并于各樣本中取1 μg 的RNA，分別加入M-MLV 緩沖液4 μL、M-MLV 1 μL、RNasin 0.5 μL、DNTP 2 μL，無RNA 酶水至20 μL，通過逆轉(zhuǎn)錄反應合成cDNA?；?-??Ct法計算mRNA 表達水平。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 中的PCR 反應引物Tab 1 PCR reaction primers in RT Qpcr

1.10 統(tǒng)計學處理

所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 23.0 軟件進行分析。其中，計量資料以（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析檢驗，兩兩比較采用最小顯著性差異檢驗。以P＜0.05 代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 四妙勇安湯活性成分篩選結(jié)果

共檢索得到四妙勇安湯所有活性成分126 個，根據(jù)OB 值將各藥物排名前5 的有效活性成分基本信息見表2。

表2 四妙勇安湯活性成分Tab 2 Active ingredients of Simiao Yong'an decoction

2.2 藥-病網(wǎng)絡的構建及可視化分析

將所得到的194 個藥物靶點與617 個疾病靶點進行交互處理，總共獲得40 個藥-病靶點，見圖1A；并通過Cytoscape 軟件對藥-病靶點進行網(wǎng)絡藥理學可視化網(wǎng)絡分析，見圖1B。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡的構建及網(wǎng)絡可視化分析

圖1 藥物?疾病?靶點網(wǎng)絡Fig 1 Drug?disease?target network

將40 個藥-病靶點通過String 數(shù)據(jù)平臺進行PPI 網(wǎng) 絡 分 析，通 過Cytoscape 軟 件 對PPI 結(jié) 果 進 行網(wǎng)絡可視化分析。本網(wǎng)絡共有95 個節(jié)點，328 條邊。按照節(jié)點Degree 值將40 個靶點進行升序排列，排名較前的靶點依次為IL-6、IL-1β、MMP-9、VEGFA、MMP-2 等，見圖1C。

2.4 GO 功能富集分析結(jié)果

基于DAVID 功能分析數(shù)據(jù)平臺對40 個藥-病靶點進行GO 功能富集分析，共獲得99 條GO 功能注釋結(jié)果。根據(jù)P 值及富集靶點數(shù)目，對GO 功能分析所包含的BP、MF 及CC 富集結(jié)果進行升序排列，見圖2、表3。

圖2 藥物?疾病?靶點GO 功能分析柱狀圖Fig 2 Histogram of drug?disease?target go function analysis

表3 藥物?疾病GO 功能分析結(jié)果Tab 3 Results of drug?disease go function analysis

2.5 KEGG 通路富集分析結(jié)果

通過DAVID 功能分析數(shù)據(jù)平臺對40 個藥-病靶點進行KEGG 通路富集分析，共得到48 條富集信號通路，富集排名靠前的通路主要有JAK-STAT、HIF-1、Toll-like receptor 等信號通路，詳見通過Cy?toscape 軟件對藥-病靶點與富集通路進行網(wǎng)絡藥理學可視化分析，見圖3、表4。

2.6 各組細胞整體形態(tài)比較

空白組VSMCs 為貼壁生長細胞，平鋪于培養(yǎng)皿底部，呈現(xiàn)多角形、梭形或不規(guī)則形狀，細胞質(zhì)均勻、大小均等；模型組VSMCs 損傷后細胞形態(tài)紊亂、生長速度緩慢；四妙勇安不同劑量組干預后，細胞形態(tài)飽滿，成卵圓或梭形分布，較模型組及阿托伐他汀組生長迅速，疏密分布均勻；阿托伐他汀組細胞細胞形態(tài)較為規(guī)則，成梭形分布，較模型組生長速度快，見圖4。

圖3 藥物?疾病?靶點KEGG 富集分析結(jié)果Fig 3 Drug?disease?target KEGG enrichment analysis results

表4 藥物-疾病KEGG 富集分析結(jié)果Tab 4 Drug-disease KEGG enrichment analysis results

2.7 四妙勇安湯對VSMCs 增殖的影響

CCK8 檢測結(jié)果顯示，與空白組OD 值相比，模型組24、48 h 和72 h 的OD 值明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組OD 值相比，四妙勇安各劑量組及對照組24、48 h 和72 h 的OD 值明顯降低（P＜0.05），見表5。

BrdU 檢測結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組Br?dU 陽性細胞百分比顯著促進VSMCs 增殖（P＜0.05）；與模型組比較，四妙勇安湯各劑量組BrdU 陽性細胞百分比能明顯抑制VSMCs 增殖（P＜0.05）；四妙勇安湯高劑量組BrdU 陽性細胞百分比優(yōu)于陽性對照組（P＞0.05），見圖5、表5。

圖4 各組細胞形態(tài)學結(jié)果比較Fig 4 Comparison of morphological results of each group

表5 各組VSMCs 增殖水平的比較（±s）Tab 5 Comparison of VSMCs proliferation in each group（±s）

表5 各組VSMCs 增殖水平的比較（±s）Tab 5 Comparison of VSMCs proliferation in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別空白組模型組四妙勇安湯低劑量組四妙勇安湯中劑量組四妙勇安湯高劑量組對照組陽性細胞（%）7.65±2.43 74.68±8.91*41.23±4.67#27.45±3.24#12.13±2.56#14.62±1.45 90.773＜0.001 FP 24 h（OD）0.52±0.12 0.89±0.09*0.81±0.11#0.71±0.14#0.57±0.07#0.59±0.05 6.293 0.004 48 h（OD）0.69±0.09 1.35±0.12*0.89±0.11#0.82±0.05#0.89±0.08#0.93±0.06 19.054＜0.001 72 h（OD）0.81±0.11 1.48±0.12*0.94±0.04#0.97±0.13#1.21±0.16#1.27±0.11 13.535＜0.001

圖5 各組細胞BrdU 增殖結(jié)果比較Fig 5 Comparison of BrdU proliferation results in each group

2.8 四 妙 勇 安 湯 對VSMCs 中IL-6、IL-1β 表 達水平的影響

ELSIA 檢測結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組VSMCs 中IL-1β、IL-6 水 平 明 顯 上 升，（P＜0.05）。與模型組比較，四妙勇安湯各劑量組中IL-1β、IL-6 水 平 均 呈 現(xiàn) 下 降 趨 勢（P ＜0.05），表明四妙勇安湯可改善因ox-LDL 所誘導的ASO所造成的炎癥反應，且呈劑量依賴性，見表6。

2.9 四妙勇安湯對VSMCs 中PCNA、JAK2 和STAT3 mRNA 表達水平的影響

RT-PCR 檢測結(jié)果顯示：與空白組相比，模型組PCNA mRNA 表達水平顯著上調(diào)；與模型組相比，四妙勇安各劑量組的PCNA mRNA 表達呈劑量依賴性下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），四妙勇安高劑量組與陽性對照組相比，PCNA mRNA 表達水平下調(diào)，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與空白組相比，模型組JAK2、STAT3 mRNA 表達水平顯著上調(diào)；與模型組相比，四妙勇安各劑量組JAK2、STAT3 mRNA 表達呈劑量依賴性下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表7。

表6 各組細胞中IL?6、IL?1β 水平的比較（±s）Tab 6 Comparison of IL?6 and IL?1 β levels in each group（±s）

表6 各組細胞中IL?6、IL?1β 水平的比較（±s）Tab 6 Comparison of IL?6 and IL?1 β levels in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別空白組模型組四妙勇安湯低劑量組四妙勇安湯中劑量組四妙勇安湯高劑量組對照組IL?1β（pg/L）0.29±0.08 0.54±0.12*0.36±0.07#0.34±0.09#0.27±0.06#0.31±0.13 3.175 0.047 FP IL?6（pg/L）7.94±0.98 11.32±1.12*9.57±1.27#7.68±1.09#7.12±0.87#7.35±0.68 7.685 0.002

表7 各組細胞中PCNA mRNA 表達比較（±s）Table 7 Comparison of PCNA mRNA expression in each group（±s）

表7 各組細胞中PCNA mRNA 表達比較（±s）Table 7 Comparison of PCNA mRNA expression in each group（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

空白組模型組四妙勇安湯低劑量組四妙勇安湯中劑量組四妙勇安湯高劑量組對照組STAT3/GAPDH 1.00±0.01 2.16±0.57*1.54±0.29#1.19±0.08#1.04±0.13#1.14±0.11 7.94 0.002組別FP PCNA/GAPDH 1.00±0.01 2.61±0.54*1.92±0.32#1.67±0.16#1.15±0.09#1.34±0.12 14.297＜0.001 JAK2/GAP?DH 1.00±0.01 1.96±0.19*1.49±0.14#1.24±0.12#1.09±0.09#1.13±0.11 25.339＜0.001

3 討論

下肢動脈硬化閉塞癥的病理因素復雜，主要包括痰濁瘀血致肢端脈道不利、氣血不能伸達四末、濡潤失職、故出現(xiàn)皮槁肉枯，甚則骨節(jié)缺血壞死，病機主要為脈絡瘀阻。四妙勇安湯作為治療脫疽的經(jīng)典方劑，藥效復雜，可通過多靶點、多通路共同發(fā)揮治療ASO 的作用。若通過實驗逐一明確其作用機制比較困難，故本研究通過網(wǎng)絡藥理學篩選四妙勇安湯治療ASO 的活性成分，獲取作用靶點，構建成分-靶點網(wǎng)絡，進行GO 功能分析及KEGG 富集分析。結(jié)果表明與治療ASO 相關度較高的化合成分126 種，作用靶點40 個，涉及信號通路48 條。本研究通過蛋白互作網(wǎng)絡（PPI）分析發(fā)現(xiàn)藥-病相關密切的 靶 點IL-6、IL-1β、MMP-9 等，其 中IL-6、IL-1β等與炎癥反應相關的通路有關［11-13］。實驗研究證實，IL-6 在炎癥反應的調(diào)節(jié)中至關重要，是炎性反應的重要介質(zhì)，而炎癥反應則是近年倍受關注的一種周圍血管性疾病的誘導因素之一，IL-6 作為急性期細胞因子，通過釋放大量白細胞聚集，達到刺激局部炎癥的作用，增加動脈斑塊的不 穩(wěn)定性［14］。ASO 發(fā)病過程中，IL-1β 的過表達導致脂質(zhì)代謝紊亂、促進內(nèi)皮細胞表達及提 高 促 炎 分 子IL-1、IL-6 表 達 水 平［15］。已 有 研究證實，四妙勇安湯可以通過抑制炎癥細胞信號通路的相關蛋白起到防治動脈硬化形成的作用［16，17］。這與本研究的網(wǎng)絡藥理學結(jié)果是相似的。

PCNA 作為與細胞增殖相關的DNA 合成蛋白，是公認的細胞增殖標記物，其表達上調(diào)或下調(diào)提示細胞增殖水平的上升或下降，PCNA 含量與DNA 合成一致，是G1～S 期細胞調(diào)控蛋白，對調(diào)控細胞增殖起到關鍵作用［18-20］。因此，通過觀察PCNA 蛋白的含量的變化，能夠很好地反映出VSMCs 的增殖情況。JAK/STAT 通路是近年來才被發(fā)現(xiàn)的由細胞因子刺激的信號轉(zhuǎn)導通路，主要參與細胞增殖、分化、凋亡，且對免疫調(diào)節(jié)等諸多生物學過程起到關鍵調(diào)節(jié)作用［21］。該信號通路主要由上游JAK 蛋白家族、下游轉(zhuǎn)錄因子STAT 家族及酪氨酸激酶相關受體組成。各細胞因子與受體結(jié)合，加速受體二聚體化進程，被活化的STAT3 蛋白以二聚體形式與核內(nèi)靶基因結(jié)合，參與基因轉(zhuǎn)錄，引發(fā)受體偶聯(lián)的JAK 激酶靠近，激活所交互的酪氨酸發(fā)生磷酸化［22］。ASO 作為一種慢性炎癥反應過程，涉及包括VSMCs 和炎癥細胞在內(nèi)的多種細胞的參與，在炎癥反應過程中，VSMCs 由靜止收縮轉(zhuǎn)為分泌增殖，產(chǎn)生大量細胞及生長因子，其增殖及遷移同樣是引起動脈內(nèi)膜增殖及血管管腔狹窄的關鍵因素；相關研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥對JAK/STAT 信號通路具有一定干預作用，中醫(yī)藥可通過抑制活化后的JAK2/STAT3 信號通路，發(fā)揮抗炎和抑制VSMCs 的增殖及凋亡［23-25］。 由 此 可 見，JAK/STAT 通 路 貫 穿 于ASO 的 全 過 程，加 速ASO 的 發(fā) 生 與 發(fā) 展［26，27］。

本研究以四妙勇安湯進行預治療ox-LDL 所誘導的VSMCs 模型，并以CCK-8 法及BrdU 法觀 察VSMCs 增 殖 情 況，ELISA 法 檢 測IL-6、IL-1β 水 平，RT-PCR 法 檢 測 PCNA、JAK2 及STAT3 mRNA 表達水平，探討四妙勇安湯在抑制VSMCs 增殖方面的作用機制。結(jié)果顯示，隨著時間推移，四妙勇安各劑量組能夠顯著抑制VSMCs 增殖（P＜0.05）；與空白組相比，模型組BrdU 陽性細胞百分比顯著促進VSMCs 增殖（P＜0.05）；與模型組比較，四妙勇安湯各劑量組BrdU 陽性細胞百分比能明顯抑制VSMCs 的增殖（P＜0.05）；此外，四妙勇安湯能夠抑制PC?NA、JAK2、STAT3 mRNA 表達（P＜0.05）；在此基礎上，本研究繼續(xù)采用RT-PCR 法觀察VSMCs 中PCNA、JAK2 及STAT3 mRNA 表 達水平，發(fā)現(xiàn)四妙勇安湯能夠顯著抑制VSMCs 中PCNA、JAK2 及STAT3 mRNA 表達（P＜0.05）。

綜上所述，四妙勇安湯能夠通過抑制IL-6及IL-1β 水 平，下 調(diào)VSMCs 中PCNA 及JAK2、STAT3 mRNA 表達水平，調(diào)控VSMCs 的增殖，達到抑制ASO 的作用。