藍(lán) 艷 方蓓倩 林 娜 雷后興 張曉芹#

1 麗水市中醫(yī)院 浙江 麗水 323000

2 衢州市食品藥品檢驗(yàn)研究院 浙江 衢州 324000

蓬蘽為薔薇科懸鉤子屬植物蓬蘽（Rubus hirsutus Thunb.）的根或全株[1]，畬族又名布袋扭、牛奶扭、扭葉等，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕之功效。國(guó)內(nèi)目前對(duì)蓬蘽的研究相對(duì)較少，主要涉及蓬蘽的本草學(xué)考證[2]、果實(shí)及葉片營(yíng)養(yǎng)成分分析[3]、組培及快繁[4]、臨床療效[5]等研究。朱月嬌[5]根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)證實(shí)，蓬蘽對(duì)于哺乳期乳癰具有較好的療效。對(duì)蓬蘽的組培進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)利用蓬蘽莖段和葉片均可達(dá)到較好的繁殖效果[6]，蓬蘽不僅可做藥用，也具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，一旦開發(fā)利用，成熟的組培技術(shù)可保證蓬蘽資源的大規(guī)模栽培。目前尚未有人對(duì)蓬蘽的安全性應(yīng)用進(jìn)行研究，本文基于液質(zhì)聯(lián)用和電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）法，建立了蓬蘽中農(nóng)藥殘留及重金屬的檢測(cè)方法，為蓬蘽的應(yīng)用安全性提供一定的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器：Waters XEVO TQ-XS超高效液相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)沃特斯公司）；Agilent 7900型電感耦合等離子質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；Mμltiwave PRO微波消解儀（安東帕公司）；mlli-Q Advab-tage A10系列超水水處理系統(tǒng)（美國(guó)MERK ml-LIPORE公司）；XP-205型十萬(wàn)分之一分析天平（梅特勒）；移液器（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2 材料：2.5μg/ml鎘（Cd）、5.0μg/ml砷（As）、5.0μg/ml鉛（Pb）、125μg/ml銅（Cu）多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)：20D3154）和100μg/ml金（Au）標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)：215125001-01）購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心；10μg/ml 汞（Hg）標(biāo)準(zhǔn)溶液（批號(hào)：10-125HGY2）以及 100μg/ml 銦（In）、鉍（Bi）、鋱（Tb）、鈧（Sc）、鍺（Ge）、鋰（Li）、镥（Lu）、銠（Rh）內(nèi)標(biāo)液（批號(hào)：5-221MKBY2）購(gòu)自Agilent科技有限公司；30種農(nóng)殘混合對(duì)照品（批號(hào)：2190538），濃度均為100μg/ml，均購(gòu)自迪馬科技有限公司；濃硝酸（優(yōu)級(jí)純，默克公司）；超純水由二次去離子水經(jīng)mlli-Q超純水處理系統(tǒng)而得（電阻率≥18.2 MΩ）。

1.3 樣本：10批蓬蘽樣品經(jīng)麗水市中醫(yī)院中藥飲片驗(yàn)收小組鑒定為薔薇科懸鉤子屬植物蓬蘽（Rubus hirsutus Thunb）的全草。樣品采集地點(diǎn)時(shí)間信息：寧波市余姚市四明山（2019.8.13）、紹興市越城區(qū)紹興第七人民醫(yī)院（2018.11.25）、衢州市開化縣衛(wèi)生學(xué)校（2019.3.18）、金華市蘭溪市新宅村（2019.10.24）、麗水市蓮都區(qū)余嶺村里山自然村（2018.3.24）、麗水市青田縣禎旺鄉(xiāng)尖山村仰天湖（2019.10.25）、麗水市縉云縣樊莊村（2019.10.25）、舟山市普陀區(qū)蝦峙鎮(zhèn)沙峧村（2018.9.28）、溫州市樂清市北雁蕩山（2018.10.18）、金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院百草園（2018.9.2）。

2 方法與結(jié)果

2.1 蓬蘽中農(nóng)藥殘留的測(cè)定：分述如下。

2.1.1 色 譜 條 件 ：watersACQUITYUPLC?BEHC18（2.1mm×100mm，1.7μm）色譜柱，柱溫40oC，流動(dòng)相A：0.1%甲酸溶液（含5mmol/L甲酸銨），B：乙腈-0.1%甲酸溶液（含5mmol/L甲酸銨）（95：5），進(jìn)樣體積1μl,流速0.3ml/min，梯度洗脫：0～1min，95%A，1～12min，95%A→75%A，12～14min，75%A→45%A，14～16min，45%A→95%A。

2.1.2 質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子掃描模式（MRM），毛細(xì)管電壓2500V；脫溶劑氣溫度500℃；去溶劑氣流速6L/min；噴霧器壓力7.0Bar；分析儀LM分辨率1：3.00HM；碰撞氣體流量：0.15ml/min。

2.1.3 混合對(duì)照品溶液的制備：精密量取禁用農(nóng)藥混合對(duì)照品溶液（已標(biāo)示各相關(guān)農(nóng)藥品種的濃度）0.5ml，置50ml量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，再取1.00ml，置10ml量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，即得（100ng/ml）。

2.1.4 基質(zhì)混合對(duì)照溶液的制備：取空白基質(zhì)樣品，同供試品溶液的制備方法處理制成空白基質(zhì)溶液。分別精密量取空白基質(zhì)溶液1.0ml（7份），置氮吹儀上，40℃水浴濃縮至約0.6ml，分別加入混合對(duì)照品溶液（L0）10μl、20μl、50μl、100μl、150μl、200μl，加乙腈稀釋至1ml，渦旋混勻，即得1ng/ml（L1）、2ng/ml（L2）、5ng/ml（L3）、10ng/ml（L4）、15ng/ml（L5）、20ng/ml（L6）系列濃度混合對(duì)照溶液。

2.1.5 供試品溶液的制備：取供試品粉末（過(guò)三號(hào)篩）3g，精密稱定，置50ml聚苯乙烯具塞離心管中，加入1%冰醋酸溶液15ml，渦旋使藥粉充分浸潤(rùn)，放置30min，精密加入乙腈15ml，渦旋使混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（500次/分）5min，加入無(wú)水硫酸鎂與無(wú)水乙酸鈉的混合粉末（4：1）7.5g，立即搖散，再置振蕩器上劇烈振蕩（500次/分）3min，于冰浴中冷卻10min，離心（每分鐘4000轉(zhuǎn)）5min，取上清液9ml，置預(yù)先裝有凈化材料的分散固相萃取凈化管（無(wú)水硫酸鎂900mg，N-丙基乙二胺300mg，十八烷基硅烷鍵合硅膠300mg，硅膠300mg，石墨化碳黑90mg）中，渦旋使充分混勻，置振蕩器上劇烈振蕩（500次/分）5min使凈化完全，離心（每分鐘4000轉(zhuǎn)）5分鐘，精密吸取上清液5ml，置氮吹儀上于40℃水浴濃縮至約1.0ml，加乙腈稀釋至2.0ml，渦旋混勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取2.1.4中L1～L6,分別進(jìn)樣1μl,測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得到線性關(guān)系，測(cè)定的相關(guān)系數(shù)均＞0.99。

2.1.7 精密度試驗(yàn)：取10ng/ml的混合對(duì)照品溶液，按“2.1.1”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，各農(nóng)藥指標(biāo)的峰面積精密度均＜9%。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取同一份樣品3g，平行取樣6份，按“2.1.1”色譜條件測(cè)定，除涕滅威、殺蟲脒、甲基異柳磷外，其余農(nóng)藥的含量RSD均＜7%。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一份樣品3g，分別在0、2、4、6、8、12、16、24h測(cè)定，結(jié)果表明各農(nóng)藥的穩(wěn)定性RSD均＜7%。

2.1.10 回收率試驗(yàn)：取已知含量的樣品6份，分別精密加入等量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果除殺蟲脒外，其余各農(nóng)藥的平均加樣回收率為69.133%～93.167%，除涕滅威、殺蟲脒、甲基異柳磷外，其余農(nóng)藥加樣回收率的RSD均＜10%。

2.1.11 樣品測(cè)定：按“2.1.5”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果10份樣品均未檢出農(nóng)藥殘留。

2.2 重金屬及有害元素含量的測(cè)定：分述如下。

2.2.1 儀器參數(shù)：射頻功率：1.5kW；采樣深度：10mm；等離子氣（Ar）流量：15.0L/min；輔助氣（Ar）流量：0.8L/min；載氣（Ar）流量：0.7L/min；霧化室溫度：2℃；氦碰撞模式：He氣流量：3.0ml/min；蠕動(dòng)泵：0.3rps；測(cè)量點(diǎn)數(shù)/峰：3；數(shù)據(jù)采樣模式：跳峰采集模式；重復(fù)次數(shù)：3。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備：精密量取上述Pb、As、Cd、Cu多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液2ml，Hg標(biāo)準(zhǔn)溶液(1μg/ml)2.5ml至50ml量瓶中，用5%硝酸稀釋至刻度，搖勻，即得每1ml含 Pb、As 0.2μg,含 Cd 0.1μg，含 Cu 5μg，含 Hg 0.05μg的混合對(duì)照品溶液①。分別量取混合對(duì)照品溶液①0.2ml，0.5ml，1.0ml，2.5ml，5.0ml，至 50ml量瓶中，用5%硝酸稀釋得到系列標(biāo)準(zhǔn)混合溶液。

2.2.3 內(nèi)標(biāo)溶液的制備：取1.00ml含100μg/ml In、Bi、Tb等元素內(nèi)標(biāo)液于100ml容量瓶中，用5%硝酸稀釋至刻度，混勻即得。

2.2.4 供試品溶液的制備：精密稱定樣品0.2g置于消解罐中，加入5ml硝酸，置趕酸板上120℃預(yù)消解20 min，冷卻后，密封，微波消解。冷卻后將消解液轉(zhuǎn)移至50ml容量瓶中，加入金標(biāo)準(zhǔn)溶液（1μg/ml）200μl，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.5 空白溶液的制備：除不加200μl金元素溶液之外，其他均同“2.2.4”供試品溶液制備。

2.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限：取“2.2.2”中已配好的線性用標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與內(nèi)標(biāo)溶液同時(shí)進(jìn)樣，按“2.2.1”項(xiàng)下測(cè)定，根據(jù)各元素的響應(yīng)值（CPS），以各元素的濃度為橫坐標(biāo)，各元素與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)元素的CPS的比值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限結(jié)果見表1。

2.2.7 精密度試驗(yàn)：取標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，Cu、As、Cd、Hg、Pb各元素的RSD均＜4%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一樣品，平行進(jìn)樣6份，按“2.2.1”項(xiàng)測(cè)定，Cu、As、Cd、Hg、Pb各元素的RSD均＜5%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一樣品，按照“2.2.4”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)分別在0、2、4、6h測(cè)定，Cu、As、Cd、Hg、Pb各元素的RSD均＜4%，表明方法穩(wěn)定性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn)：取已知含量的樣品6份，分別精密加入等量的對(duì)照品溶液，按照“2.2.4”項(xiàng)下制備，按“2.1.1”項(xiàng)下測(cè)定，計(jì)算得到各元素的加樣回收率在69.62%～108.64%，Pb元素的RSD為6.17%，其余4個(gè)元素的RSD均4%。

2.2.11 樣品測(cè)定：精密稱定各批次樣品0.2g，按“2.2.4”項(xiàng)下制備樣品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算各元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)（見表2）。10批樣品中，Cu的含量范圍為2.9602～12.6669μg·g-1，As的含量范圍為0.0855～1.0225μg·g-1，Cd的含量范圍為 0.0405～0.2633μg·g-1，Hg的含量范圍為 0.0277～0.0829μg·g-1，Pb的含量范圍為0.3579～4.0298μg·g-1。

3 討論

本文基于QuEChERS-三重四級(jí)桿高效液相色譜儀建立了蓬蘽中30種農(nóng)藥殘留的含量測(cè)定方法，除了殺蟲脒加樣回收率尚未達(dá)到60%以外，其余29種農(nóng)殘的重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率均符合要求，可為蓬蘽農(nóng)藥殘留的測(cè)定提供參考?；贗CP-MS建立了蓬蘽中5種重金屬元素的含量測(cè)定方法，結(jié)果建立的方法重復(fù)性、穩(wěn)定性、加樣回收率均符合要求，可為蓬蘽重金屬或有害元素的測(cè)定提供參考。

研究結(jié)果表明，蓬蘽未檢出農(nóng)藥殘留；不同產(chǎn)區(qū)蓬蘽中均檢測(cè)到5種重金屬，且不同產(chǎn)地其所含中間數(shù)含量差異明顯。根據(jù)《中國(guó)藥典》2020版規(guī)定，中藥中重金屬及有害元素限度為：Cu≤20mg/kg，As≤2mg/kg，Cd≤0.3mg/kg，Hg≤0.2mg/kg，Pb≤5mg/kg，由表2可知，蓬蘽中重金屬含量均符合要求。本研究所用試驗(yàn)材料均為野生采集，并不存在人為施肥或噴灑農(nóng)藥的情況，因此，蓬蘽中檢測(cè)出的重金屬可能來(lái)自環(huán)境污染或土壤污染，這提示我們土壤中重金屬含量在藥材中可進(jìn)行富集，因此在種植農(nóng)作物或藥材時(shí)，應(yīng)按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，嚴(yán)格控制農(nóng)藥及肥料的使用[7，8]。