王日明，寧雪，任躍英

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

黑色素瘤屬于臨床中一種惡性腫瘤，主要發(fā)生在患者的肢端的皮膚以及皮膚黏膜處。經(jīng)過(guò)流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，全球近年來(lái)黑色素瘤患者人數(shù)逐年增加，并且患者死亡率較高，對(duì)人們的生命健康產(chǎn)生嚴(yán)重的威脅[1]。相關(guān)研究顯示，黑色素瘤目前的發(fā)病機(jī)制尚不明確，如果患者長(zhǎng)時(shí)間在日光紫外線中暴露，會(huì)增加患者患黑色素瘤的風(fēng)險(xiǎn)[2]。黑色素瘤作為一種惡性腫瘤，其特點(diǎn)是患者發(fā)病較為隱匿，并且轉(zhuǎn)移時(shí)間早，患者容易復(fù)發(fā)，部分患者存在放化療抵抗，因此患者死亡率較高[3]。在臨床治療中，黑色素瘤主要通過(guò)手術(shù)切除進(jìn)行治療，但是對(duì)患者產(chǎn)生的傷口較大，容易復(fù)發(fā)；靶向治療效果雖然理想，但是患者容易產(chǎn)生耐藥性，治療有效時(shí)間相對(duì)較短；免疫治療黑色素瘤，不能延長(zhǎng)患者生存期，并且患者所用藥物具有較高的毒性，低反應(yīng)率等[4,5]。因此在臨床中尋找積極有效新型的藥物治療黑色素瘤對(duì)患者來(lái)說(shuō)具有重要意義。

近年來(lái)，我國(guó)中草藥在臨床應(yīng)用越來(lái)越廣，其特點(diǎn)是種類(lèi)多樣，對(duì)患者帶來(lái)的副作用較小，在藥物研發(fā)方面，我國(guó)存在獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。中醫(yī)認(rèn)為，黃芩性甘，具有補(bǔ)氣益血、益氣固表的功效[6]。研究指出，黃芪甲苷含量是決定黃芪質(zhì)量的重要指標(biāo)，在黃芪中含量較低，加上黃芪作為一種中藥材其成分較為復(fù)雜，導(dǎo)致提取困難增加[7]。已經(jīng)有研究證實(shí)，黃芪甲苷只黃芪提取物中的有效成分之一，其主要作用是對(duì)腦缺血損傷有一定的保護(hù)作用，在抗炎、抗病毒等方面較為突出，同時(shí)具有一定的降糖、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化應(yīng)激等作用[8,9]。

臨床中有大量研究認(rèn)為，黃芪甲苷在抑制肝癌、肺癌、卵巢癌等多種癌癥增殖以及侵襲方面抑制作用顯著，可以作為一種潛在的腫瘤藥物[10,11]。但關(guān)于黃芪甲苷對(duì)黑色素瘤影響的相關(guān)研究較少。本文旨在通過(guò)對(duì)黃芪甲苷含量進(jìn)行測(cè)定，研究對(duì)黑色素瘤B16 細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芪甲苷由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供（純度95%，批號(hào)：0624-200709），由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院李赫男副教授鑒定；黑色素瘤B16 細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 試劑與儀器

細(xì)胞培養(yǎng)基、磷酸緩沖液（PBS）、胎牛血清，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CCK-8 試劑盒，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；DPPH、Vc、MTT，Sigma公司；Caspase-3、Bcl-2、Bax、β-catenin 一抗，美國(guó)Abcam 公司；胰酶、GAPDH，美國(guó)Gibco 公司；MEM培養(yǎng)基，Procell 公司；Annexin V/PI 試劑盒，珠海健康元生物公司；流式細(xì)胞儀，北京索萊寶科技有限公司；倒置熒光顯微鏡，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；CO2培養(yǎng)箱，德國(guó)Heraeus 公司；蛋白凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad 公司；其他均為分析純?cè)噭?/p>

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃芪甲苷抗氧化、還原能力實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1 溶液配制

分為空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（1 mg/mL）、低濃度組（10 mg/mL）、中濃度組（25 mg/mL）、高濃度組（100 mg/mL）。Vc 溶液為0.1 g Vc 溶于100 mL 的蒸餾水中。黃芪甲苷采用蒸餾水配制成10、20、50 mg/mL溶液。

1.3.1.2 還原能力測(cè)定

采用鐵氰化鉀還原法檢測(cè)：將各組溶液滴加2.5 mL 的1%鐵氰化鉀，在50 ℃環(huán)境中孵育20 min，再次滴加1 mL 的10%的三氯乙酸，離心處理10 min，分離上層溶液，加蒸餾水和0.1%的FeCl2混合均勻，在700 nm 位置觀察各組吸光度值（A）。

1.3.1.3 DPPH 自由基清除能力測(cè)定

取各組0.5 mL 的黃芪甲苷溶液加0.5 mL 的DPPH·溶液，A樣品為0.5 mL 的黃芪甲苷溶液+無(wú)水乙醇吸光度；A空白為0.5 mL 的樣品溶液加0.5 mL 的蒸餾水吸光度。

DPPH 自由基清除率/%=[1-(A樣品-A空白)]×100%

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將黑色素瘤B16 細(xì)胞采用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗3 次，在離心試管中加入少量的MEM 培養(yǎng)液。將其剪成1 mm×1 mm×0.5 mm，離心處理后將上清液摒棄，加3 mL/L 中的Ⅰ型膠原酶，在37 ℃、50 mL/L CO2孵育箱中處理30 min，加培養(yǎng)液反應(yīng)終止，再次離心處理分離后，將細(xì)胞在培養(yǎng)皿中平鋪，使用玻璃蓋片將組織覆蓋，在MEM 培養(yǎng)液中加入200 mL/L的胎牛血清，在孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每間隔3 d 更換一次培養(yǎng)液，在倒置顯微鏡下觀察人黑色素瘤A375細(xì)胞株生長(zhǎng)情況，等到細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿底80%，加2.5 g/L 胰蛋白酶給予消化，1:3 傳代，采集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的第一代細(xì)胞。

1.3.3 細(xì)胞增殖試驗(yàn)

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的黑色素瘤B16 細(xì)胞，根據(jù)5×104個(gè)/mL 的密度將細(xì)胞接種在96 孔培養(yǎng)板中，每孔中加100 μL。培養(yǎng)24 h 后觀察細(xì)胞貼壁情況，將培養(yǎng)液摒棄后，對(duì)照組中加入100 μL 的培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組中分別加入100 μL 濃度為25、50、100 μmol/L 的黃芪甲苷培養(yǎng)液，每組中有5 個(gè)復(fù)孔。加黃芪甲苷用藥72 h 后，每孔中加10 μL 的CCK-8 溶液，連續(xù)孵育4 h，觀察各組細(xì)胞增殖情況。

1.3.4 細(xì)胞凋亡試驗(yàn)

選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的黑色素瘤B16 細(xì)胞，采用胰酶消化后，在37 ℃ 5%的CO2環(huán)境中連續(xù)培養(yǎng)48 h，將細(xì)胞濃度稀釋到2×106個(gè)/mL，提取1 mL 的細(xì)胞懸濁液加入在離心試管中，4 ℃，以1000 r/min 離心10 min。摒棄上清液，采用PBS 連續(xù)沖洗細(xì)胞2 次，以1000 r/min 離心10 min，再次摒棄上清液，PBS 連續(xù)沖洗細(xì)胞2 次，加入200 μL 的Binding Buffer 重懸細(xì)胞，加5 μL 的Annexin-V/PI 試劑，避光保存20 min，加30 μL PBS，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3.5 增殖、凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)

采用Western Blot 檢測(cè)，將采集到的細(xì)胞10000×g離心處理10 min，對(duì)上清液進(jìn)行提取后，BCA 進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)，在2×SDS 凝膠緩沖液中加入50 μg 蛋白，在100 ℃環(huán)境中加熱5 min 有助于蛋白發(fā)生變性。凝膠電泳完、轉(zhuǎn)膜，取膜，4 ℃環(huán)境下在5%脫脂牛奶中固定、封閉處理時(shí)間為1 h，將一抗使用0.05%～0.10%TBST 給予稀釋?zhuān)–aspase-3、Bcl-2、Bax、β-catenin一抗為1:1000），4 ℃孵育過(guò)夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST 洗膜，3 次，每次為5 min，二抗被0.05%～0.10% TBST 稀釋?zhuān)?:10000），搖動(dòng)孵育時(shí)間為1 h，再次采用TBST 連續(xù)洗膜3 次，處理時(shí)間為5 min。DAB 顯色，定量分析蛋白表達(dá)情況。以GAPDH為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。p＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃芪甲苷的還原能力和DPPH 自由基清除能力

表1 黃芪甲苷發(fā)還原能力和DPPH 自由基清除能力Table 1 Reducing ability and DPPH free radical scavenging capacity of astragaloside IV (±s)

表1 黃芪甲苷發(fā)還原能力和DPPH 自由基清除能力Table 1 Reducing ability and DPPH free radical scavenging capacity of astragaloside IV (±s)

注：同列數(shù)據(jù)字母不同表示差異性顯著，p＜0.05，下同。

組別 濃度/(mg/mL) 吸光度值 DPPH 自由基清除率/%對(duì)照組 - 0.16±0.01a -Vc 組 1 0.75±0.05b 66.50±0.15a低濃度組 10 0.42±0.03c 28.35±0.29b中濃度組 20 0.65±0.02d 45.35±0.26c高濃度組 50 0.92±0.09e 70.82±0.27a

還原能力在物質(zhì)抗氧化能力中具有重要作用，抗氧化劑清除自由基的方式是通過(guò)自身的還原作用來(lái)給出電子，還原能力越強(qiáng)，代表其抗氧化活性就越強(qiáng)[12]。DPPH 自由基是一種穩(wěn)定的含氮自由基，抗氧化活性成分反應(yīng)在其混合溶液中呈現(xiàn)深淺不同的紫色，并在517 nm 處具有最大的吸收峰。在本文實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，隨著樣品濃度的增大，吸光值越大，說(shuō)明黃芪甲苷的還原能力增強(qiáng)。10 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL 各濃度黃芪甲苷的吸光度值分別為0.42、0.65、0.92；DPPH自由基清除率分別為28.35%、45.35%和70.82%，說(shuō)明黃芪甲苷具有一定的還原能力和DPPH 自由基清除能力。

2.2 黃芪甲苷對(duì)黑色素瘤B16 細(xì)胞增殖情況的影響

腫瘤發(fā)展受腫瘤細(xì)胞不斷增殖、異常分化有關(guān)，還與細(xì)胞凋亡障礙有關(guān)[13]。相關(guān)研究表明，一旦腫瘤細(xì)胞凋亡被抑制，腫瘤細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生[14]。目前臨床中主要通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)進(jìn)行腫瘤治療。黃芪甲苷對(duì)黑色素瘤B16 細(xì)胞的抑制增殖見(jiàn)表2，表2 結(jié)果表明，黃芪甲苷作用后，黑色素瘤B16 細(xì)胞的增殖率均出現(xiàn)不同程度的降低，特別是在72 h 處理后，高濃度組黑色素瘤B16細(xì)胞增殖率為15.55%，顯著低于低濃度組的32.55%和中濃度組的20.25%，并且，在同一濃度條件下，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的增殖率也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，表現(xiàn)出一定的濃度依賴，與安小翠[15]研究結(jié)果保持一致。

2.3 黃芪甲苷對(duì)黑色素瘤B16 細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡屬于一種主動(dòng)性死亡形式，其目的是為了適應(yīng)細(xì)胞中的環(huán)境而發(fā)生改變，正常生理下的細(xì)胞凋亡，有助于將機(jī)體中異常、衰老的細(xì)胞清除，從而維持機(jī)體內(nèi)部環(huán)境平衡[16]。細(xì)胞凋亡過(guò)程是自由基因?qū)?xì)胞主動(dòng)自殺進(jìn)行編碼調(diào)控的過(guò)程，有助于維持機(jī)體自身的穩(wěn)定，保證細(xì)胞數(shù)量動(dòng)態(tài)處于一種動(dòng)態(tài)平衡，在這一過(guò)程應(yīng)用于臨床中能成功誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[17]。黃芪甲苷對(duì)黑色素瘤B16 細(xì)胞凋亡的影響見(jiàn)表3，結(jié)果表明，黃芪甲苷處理能不同程度的提高細(xì)胞的凋亡率，50 mg/mL 作用72 h 后，其對(duì)黑色素瘤B16 細(xì)胞凋亡率達(dá)到了40.45%，且在不同的處理時(shí)間段，呈現(xiàn)出濃度依賴特性，說(shuō)明黃芪甲苷對(duì)黑色素瘤B16 細(xì)胞的凋亡有較好的促進(jìn)作用。

表2 不同處理時(shí)間黑色素瘤B16 細(xì)胞的增殖率（%）Table 2 Proliferation rate of melanoma B16 cells at different treatment time

表3 黃芪甲苷對(duì)黑色素瘤B16 細(xì)胞凋亡的影響（%）Table 3 Effect of astragaloside IV on apoptosis of melanoma B16 cells

表4 各組黑色素瘤B16 細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Table 4 Expression of proliferation and apoptosis related proteins of melanoma B16 cells in each group

2.4 黃芪甲苷對(duì)黑色素瘤B16 細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

在細(xì)胞凋亡增殖過(guò)程中有較多的信號(hào)通路以及相關(guān)分子參與，其中Caspase 家族在這一過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Caspase 家族能切斷其下游效應(yīng)因子信號(hào)通路，對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行重組，將DNA 復(fù)制和修復(fù)途徑關(guān)閉后，有助于凋亡小體發(fā)揮誘導(dǎo)作用，特別是Caspase-3 發(fā)揮著重要作用[18]。Bcl-2 主要在線粒體中廣泛存在，能調(diào)節(jié)線粒體膜，Bax 與Bcl-2 之間聯(lián)系緊密，在細(xì)胞凋亡中具有重要作用[19]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路屬于一種保守信號(hào)通路，參與細(xì)胞增殖、分化等過(guò)程。在正常機(jī)體中，β-catenin 主要通過(guò)泛素蛋白酶體介導(dǎo)，其表達(dá)水平較低，研究結(jié)果顯示，在黑色素瘤中，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路能起到治療黑色素瘤的效果[20]。黃芪甲苷對(duì)黑色素瘤B16 細(xì)胞相關(guān)通路蛋白表達(dá)的影響見(jiàn)表4，結(jié)果表明，隨著作用濃度的增大，黃芪甲苷能顯著提高Caspase-3 和Bcl-2 蛋白的表達(dá)并顯著降低Bax 和β-catenin 的表達(dá)（p＜0.05），高濃度黃芪甲苷作用下，Caspase-3、Bcl-2、Bax、β-catenin蛋白的表達(dá)量分別為0.56、0.58、0.27、0.25，顯著區(qū)別與其他各實(shí)驗(yàn)組（p＜0.05）。說(shuō)明黃芪甲苷能通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，調(diào)控Caspase-3、Bcl-2、Bax、β-catenin 表達(dá)，起到抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡的作用。

圖2 各組黑色素瘤B16 細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較（W B）Fig.2 Comparison of proliferation and apoptosis related protein expression of melanoma B16 cells in each group

3 結(jié)論

研究認(rèn)為，黃芪甲苷具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗病毒、抗應(yīng)激、改善心肺功能等功效，有著“超級(jí)黃芪多糖”的美譽(yù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪甲苷具有較好的體外抗氧化活性，隨著濃度的提升，其還原能力和DPPH自由基清除能力具有大幅提高；同時(shí)，在高濃度（50 mg/mL）處理下，黃芪甲苷能顯著抑制黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡，相關(guān)蛋白的表達(dá)也佐證了黃芪甲苷能通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，調(diào)控Caspase-3、Bcl-2、Bax、β-catenin 蛋白的表達(dá)，從而抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖。