劉春紅，林麗，肖茹雪，崔偉東，趙子健，李盛鈺

（1.長春大學(xué)特殊教育學(xué)院，吉林長春 130022）（2.吉林省命之元生物科技有限公司，吉林長春 130022）（3.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林長春 130033）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)囊腫脹、病變等為主要癥狀的慢性自身免疫性疾病，其發(fā)生發(fā)展與大量炎癥細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的釋放有關(guān)，主要病理變化為慢性滑膜炎，并逐漸表現(xiàn)為軟骨以及骨破壞，最終導(dǎo)致患者發(fā)生關(guān)節(jié)畸形甚至關(guān)節(jié)功能喪失，是我國造成勞動(dòng)力喪失和致殘的主要病因之一[1]。臨床上應(yīng)用非甾體類抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、甲氨蝶呤等藥物治療，主要以減輕疼痛、控制關(guān)節(jié)炎的發(fā)展速度和防止關(guān)節(jié)軟骨損害為主。盡管這些藥物可在一定程度上改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀，但長期使用會(huì)造成抑制機(jī)體免疫功能、誘發(fā)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者感染等嚴(yán)重的不良反應(yīng)[2]。

最新的研究證據(jù)表明，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展與腸道微生物群的改變關(guān)系十分密切[3,4]。乳桿菌是人類腸道中最重要的共生微生物之一，在調(diào)解腸道菌群平衡、改善腸道功能中發(fā)揮著重要作用[5]，其在調(diào)節(jié)自身免疫功能，特別是改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用研究越來越多的被關(guān)注。在一些類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究中，益生菌的使用改善了臨床表現(xiàn)，減少了促炎細(xì)胞因子，增加了調(diào)節(jié)細(xì)胞因子。例如，鼠李糖乳桿菌GG 活菌和死菌對(duì)T 細(xì)胞依賴性實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎具有明顯的預(yù)防和治療作用[6]。在小鼠模型中，瑞士乳桿菌SBT2171 的體內(nèi)感染阻止了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[7]。另外，針對(duì)益生菌在治療炎癥和免疫缺陷疾病方面的療效，隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)證明，補(bǔ)充特定益生菌具有抗炎作用，有助于增加類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的日?；顒?dòng)和緩解癥狀[8,9]。

目前，益生菌作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎預(yù)防或治療的一種潛在方法，尚未得到系統(tǒng)的研究，但其作用和機(jī)制正不斷被揭示。利用益生菌作為輔助治療被認(rèn)為是治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的一個(gè)有前途的方向。因此，本研究對(duì)自主分離的一株乳桿菌進(jìn)行了鑒定，以Ⅱ-型膠原誘導(dǎo)大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型，通過踝關(guān)節(jié)腫脹程度、血清炎癥細(xì)胞因子表達(dá)和類風(fēng)濕相關(guān)指標(biāo)的檢測，初步評(píng)價(jià)了菌株對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的輔助治療作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

API50 CHL 試劑盒，法國梅里埃公司；完全弗氏佐劑，美國Sigma 公司；牛II 型膠原，美國Chondrex公司；大鼠腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素1β（IL-1β）、白介素10（IL-10）、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、免疫球蛋白G、免疫球蛋白MELISA 試劑盒，江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SQ810C 型高壓滅菌器，日本YAMATO 公司；ELx800 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國 BioTek 公司；SorvallEvolotion RC 型高速冷凍離心機(jī)，美國Thermo公司；BX51 顯微鏡，日本Olympus 公司；Cary300紫外可見分光光度計(jì)，美國Varian 公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離與鑒定

菌株HG20 是從市售新鮮黃瓜表面中分離得到的。經(jīng)平板菌落形態(tài)觀察，單菌落顯微鏡檢、革蘭氏染色、過氧化氫酶活性檢測，初步判定為乳桿菌。

API50 CHL 碳水化合物發(fā)酵鑒定。根據(jù)生物梅里埃公司的API50 CHL 鑒定試紙條對(duì)乳桿菌的碳水化合物發(fā)酵實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。具體操作過程參照試劑盒說明書和曲菲[10]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

16S rDNA[11]和pheS基因[12]序列擴(kuò)增和比對(duì)。采用CTAB 法提取基因組DNA，根據(jù)基因序列的保守區(qū)域分別設(shè)計(jì)16S rDNA（27F：5"-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3"、1492R：5"-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3"）和pheS（p-F：5"-CCGTGAAGAACTGGAA CA-3"，p-R：5"-CCTAACCCAAAGGCAAAA-3"）引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和產(chǎn)物測序后，通過BLAST 將獲得菌株16S rDNA 和pheS序列與GenBank 庫中已知菌株的序列信息進(jìn)行同源性比對(duì)分析，鑒定待測菌株；以16S rDNA 和pheS序列同源性大于99%為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行屬種歸類。利用MEGA 5.0 軟件中的Neighbor-Joining 法構(gòu)建待測菌株與模式菌株16S rDNA 和pheS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 菌株活化及菌懸液的制備

將凍存菌株在MRS 液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代活化后，按3%（V/V）接種于MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)16 h，離心（4000 r/min，4 ℃，10 min），棄上清，滅菌生理鹽水清洗菌體沉淀兩次后，調(diào)整菌液濃度至1.0×109CFU/mL，4 ℃保存、備用。

1.3.3 動(dòng)物分組及模型建立

清潔級(jí)ICR 6～8 周齡雄性健康SD 大鼠30 只，體質(zhì)量180～200 g，購于長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分成3 組：對(duì)照組、模型組和HG20 組，每組10 只。參照造模方法[13]并稍加改動(dòng)。配制造模劑：小牛軟骨Ⅱ型膠原溶于0.1 mol/L 乙酸中配制濃度為2 mg/mLⅡ型膠原液，并按1:1（V/V）比例與完全弗氏佐劑充分混合、乳化，于4 ℃中保存?zhèn)溆?。模型組和HG20 組大鼠后足左、右側(cè)足跖部酒精擦拭后，均皮內(nèi)注射造模劑50 μL。7 d后，同樣方法加強(qiáng)注射1 次，加強(qiáng)注射后大鼠四肢足爪均嚴(yán)重腫脹，踝關(guān)節(jié)直徑增長幅度≥2 mm 為造模成功。造模成功后，HG20 組灌胃2 mL/d 濃度為1.0×109CFU/mL 的植物乳桿菌菌液，連續(xù)21 d，對(duì)照組和模型組灌胃等量生理鹽水。對(duì)照組、模型組和HG20 組大鼠均正常飲食飲水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用卷尺測量大鼠踝關(guān)節(jié)周長、采用排水法測量其足趾容積。各組大鼠心臟取血，離心（3000 r/min，4 ℃，15 min），收集血清分裝、凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 血清生化指標(biāo)測定

血清中IL-10、IL-1β、TNF-α、IgG、IgM、CRP水平測定按照試劑盒說明書操作進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 21.0 軟件，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。*表示與模型組比較差異顯著（p＜0.05），**表示與模型組比較差異極顯著（p＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌HG20 的鑒定

2.1.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

圖1 菌株HG20 形態(tài)學(xué)鑒定Fig.1 Morphological identification of strain HG20

將活化3 代的HG20 菌株于固體MRS 培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)（37 ℃，72 h），觀察菌落形態(tài)如圖1a，HG20菌落呈乳白色、邊緣整齊、表面光滑、圓形、凸起。挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡鏡檢結(jié)果見圖1b，菌株圓端呈直桿狀，單個(gè)、成對(duì)或短鏈狀。革蘭氏染色結(jié)果為陽性。過氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果為陰性。綜合分析上述結(jié)果，菌株HG20 初步鑒定為乳桿菌。

2.1.2 API50 CHL 鑒定結(jié)果

利用API50 CHL碳水化合物發(fā)酵對(duì)HG20菌株進(jìn)行鑒定。結(jié)果如表1 所示，將49 種碳水化合物發(fā)酵結(jié)果輸入API 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，該菌株鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

表1 植物乳桿菌HG20 API50 CHL 鑒定結(jié)果Table 1 Identification of L. plantarum HG20 by API50 CHL

2.1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的建立

將測序得到的乳桿菌16S rDNA 序列與NCBI 已提交的模式菌株的16S rDNA 序列進(jìn)行BLAST 同源性比對(duì)，并構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2 所示，其結(jié)果與植物乳桿菌和戊糖乳桿菌同源性較高，達(dá)到99%以上。由于16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹中，戊糖乳桿菌與植物乳桿菌親緣關(guān)系較近，無法通過16S rDNA 序列比對(duì)進(jìn)行區(qū)分，因此本研究對(duì)菌株HG20 的pheS基因進(jìn)行了測序和序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），菌株 HG20 與植物乳桿菌模式菌株L. plantarumDSM20174 基因序列相似性為100%，可以確定為植物乳桿菌。

圖2 基于16S rDNA 序列的植物乳桿菌HG20 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of L. plantarum HG20 based on 16S rDNA sequence

圖3 基于pheS 序列的植物乳桿菌HG20 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of L. plantarum HG20 based on pheS sequence

綜合上述生理生化、API50 CHL 碳水化合物發(fā)酵和特定基因序列比對(duì)的結(jié)果，菌株HG20 鑒定為植物乳桿菌（L. plantarum）。菌株由吉林省命之元生物科技有限公司于2019 年11月21 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢），保藏編號(hào)為：CCTCC NO：M2019964。

2.2 大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度

表2 植物乳桿菌HG20 株對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度影響Table 2 The effect of L. plantarum HG20 on ankle swelling of collagenous arthritis rats

圖4 對(duì)照組（a）、模型組（b）和HG20 組（c）動(dòng)物代表性后肢的形態(tài)學(xué)變化Fig.4 Morphological changes of representative hind paws of animals from the Control (a), model (b), and HG20 (c)

大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度結(jié)果如表2 所示，與模型組比較，植物乳桿菌HG20 灌胃21 d 后，大鼠踝關(guān)節(jié)周長降低65.52%，足趾容積降低61.28%，說明植物乳桿菌HG20 具有緩解膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠關(guān)節(jié)腫脹、具有明顯的抗炎效果（圖4）。另據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，與本研究的結(jié)果一致，瑞士乳桿菌SBT2171[14]和發(fā)酵乳桿菌[15]同樣對(duì)緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度具有積極意義。

2.3 血清炎癥因子檢測結(jié)果

表3 植物乳桿菌HG20 株對(duì)膠原型關(guān)節(jié)炎大鼠血清中炎癥因子影響Table 3 The effect of L. plantarum HG20 on serum inflammatory factors of collagenous arthritis rats

炎性細(xì)胞因子被認(rèn)為是導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)損傷和疾病進(jìn)展的破壞分子[16]。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病期間，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α濃度會(huì)有所上升，而抗炎細(xì)胞因子水平有所下降，這些變化會(huì)加重炎癥反應(yīng)，對(duì)滑膜和關(guān)節(jié)軟骨造成傷害[17]。本研究檢測了TNF-α、IL-1β、IL-10 等三種與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞因子，植物乳桿菌HG20 具有顯著的抗炎作用，可降低膠原型關(guān)節(jié)炎大鼠TNF-α、IL-1β水平至58.13 pg/mL、74.21 pg/mL（p＜0.01），同時(shí)使病理性降低的IL-10 水平升高55.38%，有效緩解病情，降低炎癥程度。

IL-10 等抗炎細(xì)胞因子可預(yù)防關(guān)節(jié)炎相關(guān)的炎癥損傷[18]。本研究中，植物乳桿菌HG20 抑制促炎癥細(xì)胞因子如IL-1β和TNF-α的水平，同時(shí)增加血清IL-10的產(chǎn)生，是治療膠原佐劑性關(guān)節(jié)炎的兩個(gè)主要機(jī)制。在先前的研究中，細(xì)胞因子分析的結(jié)果清楚地表明，嗜酸乳桿菌顯著增加了IL-10，還降低了IL-6 和TNF-α[19]。干酪乳桿菌在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型中也顯示了相同的結(jié)果[20]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠飼喂植物乳桿菌HG20 可能是通過降低促炎分子水平和增加IL-10 產(chǎn)生，抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。我們的研究結(jié)果與Amdeka[21]等的結(jié)論一致。

2.4 血清類風(fēng)濕相關(guān)指標(biāo)檢測

圖5 植物乳桿菌HG20 株對(duì)膠原型關(guān)節(jié)炎大鼠血清中免疫球蛋白和C-反應(yīng)蛋白水平的影響Fig.5 The effect of L. plantarum HG20 on serum immunoglobulin and CRP of collagenous arthritis rats

由圖5 所示，模型組大鼠的免疫指標(biāo)IgG、IgM和CRP 明顯升高（p＜0.01），分別達(dá)到9.42 mg/mL、14.70 μg/mL、22.11 pg/mL，灌胃植物乳桿菌HG20 后，血清中IgG、IgM 和CRP 指標(biāo)均顯著降低（p＜0.01），分別為5.08 mg/mL、9.66 μg/mL 和19.26 pg/mL。說明植物乳桿菌HG20 對(duì)膠原型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清中與激發(fā)類風(fēng)濕因子的形成和參與機(jī)體急性免疫應(yīng)答的IgG 和IgM 的表達(dá)具有顯著的抑制作用，是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要的組成部分。降低CRP 水平有助于改善急性期性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)。

CRP 作為一種免疫調(diào)節(jié)因子，屬于一種急性期反應(yīng)物，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)呈現(xiàn)出高表達(dá)的狀態(tài)[22]。有研究證明干酪乳桿菌可通過降低CRP 水平，改善膠原型大鼠關(guān)節(jié)炎癥狀[23]。植物乳桿菌細(xì)胞壁中也含有對(duì)弗氏佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥標(biāo)志物CRP 抑制的抗炎活性成分[24]。這可能是植物乳桿菌改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一種效應(yīng)物質(zhì)。本研究的結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)植物乳桿菌HG20 可通過降低血清CRP 水平，降低類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎急性期的炎癥反應(yīng)。

IgG、IgM 也是表明類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的代表性分子。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程中，誘發(fā)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的始動(dòng)因子可使機(jī)體產(chǎn)生IgG 抗體，IgG 抗體可通過自聚合引發(fā)一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而激發(fā)類風(fēng)濕因子的形成；而由Th1 細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子可介導(dǎo)IgM 亞型向IgG2a 和IgG2b 亞型的轉(zhuǎn)變[25]。Kim[26]等發(fā)現(xiàn)瑞士乳桿菌可通過降低小鼠IgG 水平和炎癥免疫反應(yīng)，預(yù)防膠原誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎。干酪乳桿菌可以通過降低大鼠血清中膠原特異性IgG 和IgG2a 水平來改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀[27]。明串珠菌也被證明可以通過降低小鼠血清中膠原特異性IgG 和IgG2a 水平來改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀[28]。研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌可降低關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清中IgM 的水平[29]。植物乳桿菌HG20通過顯著降低血清中IgG 和IgM，改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎急性期癥狀（圖4 和圖5），這與上述文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究通過形態(tài)學(xué)觀察、API50 CHL糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、16S rDNA 和pheS基因序列比對(duì)，鑒定一株分離自黃瓜表面的菌株HG20 為植物乳桿菌。植物乳桿菌HG20可抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹，降低血清中的促炎癥細(xì)胞因子和關(guān)節(jié)炎相關(guān)免疫球蛋白水平，對(duì)膠原型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有輔助治療作用。然而，植物乳桿菌HG20 影響類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的確切機(jī)制尚不清楚，還需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)和臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證，使其成為一種有前途的治療策略。