趙聲蘭，張鳳，張麗明，郭琰，陳朝銀

（1.云南中醫(yī)藥大學中藥學院，云南昆明 650500）（2.云南省林業(yè)與草原科學院，云南昆明 650201）（3.云南經濟管理學院醫(yī)學院，云南昆明 650106）

隨著生活水平的提高，2 型糖尿病的發(fā)病率逐年升高，在2040 年預計達到6.42 億人[1]。2 型糖尿病是一種由胰島素相對缺乏或敏感性下降引起的糖脂代謝性紊亂疾病，會導致糖尿病腎病、眼病及殘足等并發(fā)癥[2]。目前臨床上治療2 型糖尿病大多使用化學藥物，具有一定的副作用，相比西藥，中藥成分復雜多樣，可通過多靶點、多途徑、多層次、多環(huán)節(jié)來改善疾病，治療糖尿病具有安全、溫和、持久的優(yōu)點[3]。如：人參皂苷CK 能通過增強大鼠腎組織的抗氧化能力，抑制腎組織中TGF-β1（轉化生長因子β1）的表達，從而降低糖尿病大鼠的血糖，調節(jié)血脂[4]；肉桂多酚除了通過抗氧化機制發(fā)揮作用外，還可通過調節(jié)胰島細胞AKT（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）信號通路而促進胰島β細胞分泌胰島素，降低血糖[5]。

核桃系胡桃科（Juglandaceae）的核桃屬（JuglanLinn.）、山核桃屬（Carya）、緣核桃屬（Annamocarya）等喬木植物[6]，其果仁食用及藥用價值非常高，有健胃、補血、潤肺、養(yǎng)神、延年益壽等功效[7,8]，是我國傳統(tǒng)的藥食同源佳品。核桃仁含有萘醌及其苷類、黃酮及其苷類、二芳基庚烷類、萜類、有機酸類等化合物[9]，具有抗氧化、延緩衰老、降低血液黏度、防止血栓形成等多種生物學功能[10,11]，可用于防預防糖尿病[12]。

薈萃分析以系統(tǒng)生物學為基礎，闡述機體與藥物相互作用的原理和規(guī)律，可用來預測中藥單體或復方的各有效成分及其作用靶點和參與的相關通路，探索藥物與疾病間的關聯(lián)性，解釋藥物治療疾病的作用機制，可稱之為元分析、系統(tǒng)藥理學或網絡藥理學[13,14]。本研究運用薈萃分析探尋核桃仁化學成分防治2 型糖尿病的潛在靶點及相關通路，探討核桃仁對糖尿病的多成分-多靶點的干預作用機制，為核桃仁的開發(fā)利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 核桃仁活性成分與潛在靶點的篩選

通過TCMSP[15]（Traditional Chinese Medicine Systems pharmacology）數據庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）獲得中藥核桃仁的化學成分，篩選具有靶點的活性成分，匯集各活性成分的潛在靶點并通過Uniprot 數據庫（http://www.uniprot.org./）對藥物靶點的相關基因信息名稱進行交集統(tǒng)一。

1.2 2 型糖尿病靶點搜集

在OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）（http://www.omim.org/）、Genecards（http://www.genecards.org/）和TTD（Therapeutic Target Database）（https://db.idrblab.org/ttd/）三個疾病數據庫[16]以“Type 2 diabetes mellitus”為關鍵詞進行搜索2 型糖尿病相關靶點，并將三個數據庫的靶點進行歸并得到2 型糖尿病的靶點[17]。

1.3 藥物-活性成分-疾病-靶點網絡和PPI 網絡構建

將活性成分靶點與疾病靶點通過R3.6.2 軟件取交集，將交集靶點信息整理成Excel 格式，導入Cystoscape 3.7.2 軟件，構建核桃仁-活性成分-疾病-靶點網絡圖，并運用Meta-analysis 和Network Analyzer 插件分析網絡拓撲參數：選取節(jié)點度（Degree）前三位的活性成分為主要活性成分[18]。目前STRING（search tool for recurring instances of neighbouring genes）是蛋白質相互作用覆蓋種類最多的數據庫[19]，將交集靶點導入 STRING（https://string-db.org/cgi/input.pl）在線分析平臺進行蛋白質-蛋白質相互作用 PPI（protein protein interaction network），將獲得的PPI 數據導出為TSV文件格式并導入到Cystoscape 3.7.2 軟件繪制網絡圖，利用Metascape 和CytoNCA 插件對其進行拓撲學分析，包括度中心性（DC）、特征向量（EC）、中介中心性（BC）、接近中心性（CC），各值越大代表了該點在網絡圖中越重要，取DC、EC、BC、CC 值大于其2 倍中位數進行關鍵靶點篩選[20]。

1.4 GO 功能富集和KEGG 信號通路分析

將獲得的交集靶點在STRING 平臺進行京都基因和基因組百科全書（KEGG）的信號通路富集分析和基因本體（GO）的生物過程富集分析，以p＜0.05 進行靶基因篩選，分析核桃仁干預2 型糖尿病的主要信號通路及生物過程[21]。

2 結果與分析

2.1 核桃仁活性成分與靶點收集

表1 核桃仁的11 種潛在活性成分Table 1 11 potential active ingredients of walnut kernel

表2 核桃仁防治2 型糖尿病的28 個潛在預測靶點Table 2 Potential 28 predicted targets of walnut kernel for type 2 diabetes

在TCMSP 數據庫搜索到核桃仁有作用靶點的化學成分有11 種（見表1），共作用于83 個潛在靶點。藥物要通過由脂質雙分子層構成的生物膜進入細胞內，通常需有一定的疏水性。只有具有適宜的AlogPo/w（脂水分布系數2-6）的藥物才能在體內易于到達目標結合部位，進而發(fā)揮藥效，過高或過低需通過乳化、修飾等適當方法加以調整。口服生物利用率（OB）低的成分（如表1 中的胡桃苷、四沒食子酰葡萄糖和五沒食子酰葡萄糖）一般不宜口服給藥，可注射給藥。成藥性DL（drug-like 主要由溶解性和穩(wěn)定性等因素構成）較低的也可通過包埋、乳化等適當方法加以調整。

2.2 核桃仁活性成分干預2 型糖尿病的相關靶點

在疾病數據庫以“Type 2 diabetes mellitus”為關鍵詞搜索2 型糖尿病相關靶點，Genecards 中選擇score≥10 的靶點共獲得2968 個靶點，OMIM 數據庫獲得31 個靶點，TTD 獲得81 個靶點，合并三個數據庫的靶點共有3015 個靶點。將核桃仁活性成分靶點與2 型糖尿病靶點通過R 軟件取交集，得出28 個核桃仁干預2 型糖尿病作用靶點（見表2）。主要有SOD1、MAOB（胺氧化酶B）、CAT（過氧化氫酶）、DUOX2（雙氧化酶2）、G6PD（葡萄糖-6-磷酸脫氫酶）、GSTA2（谷胱甘肽S-轉移酶A2）等氧化還原酶類，MMP9（基質金屬蛋白酶9）、PRSS1（胰蛋白酶1）、MMP2（膠原酶IV），PTGS2（前列腺素G/H 合酶2）、FASN（脂肪酸合酶）以及激酶類的PRKCA（蛋白激酶α）、PRKCB、PRKCG、PRKCE、PRKCZ、PRKD1，因子類的IL5（白介5）、ILRL1、IGF2（胰島素樣生長因子II）、F10（凝血因子X）、F2、VEGFA（血管內皮生長因子A），以及ESR1（雌激素受體1）、NCOA2（核受體共激活劑2）等。

2.3 核桃仁活性成分-干預2 型糖尿病靶點可視化網絡

采用Cystoscape 3.7.2 軟件構建核桃仁-活性成分-疾病-靶點網絡圖（圖1），圖中包含39 個節(jié)點（1 個中藥，1 個疾病，9 個活性成分與28 個靶點），組成了74條核桃仁活性成分與2型糖尿病靶點之間相互作用關系，其中鞣花酸（ellagic acid）作用于GSTA2、MMP2、MMP9、PRKCB和AR等8 個靶點，五沒食子酰葡萄糖（Pentagalloylglucose）作用于PRKCB、PRKCZ、FASN和F2等8 個靶點，胡桃醌（juglone）作用于G6PD1、DUOX2、IL-5和SOD等6 個靶點，euprostin A 作用于PRKCB、PRKCZ和PRKCA等靶點，9-環(huán)丙基壬酸甲酯（Methyl 9-cyclopropylnonanoate）分別作用于PTGS2、MAOB和NCOA2等靶點，2,2",3,3",4,4"-四甲氧基-6,6"-聯(lián)苯二甲酸二甲酯（2,2",3,3",4,4"-Tetramethoxy-6,6"-biphenyldicarboxylic acid，dimethyl ester）作用于KCNMA1（鈣激活鉀通道亞基α1）和PTGS2等靶點，沒食子單寧（Eugeniin）、胡桃苷（Juglanin）分別作用于2 個靶點，且PRKCA、PRKCB和PRKCE等靶點同時對應于euprostin A 和Methyl 9-cyclopropylnonanoate 等活性成分，F(xiàn)2和F10等靶點同時對應于Eugeniin、Methyl 9-cyclopropylnonanoate等成分，體現(xiàn)出中藥多成分、多靶點的作用體系。

根據拓撲學分析，節(jié)點度為前三位的是五沒食子酰葡萄糖(9)、鞣花酸(8)和胡桃醌(6)，有相關文獻報道，五沒食子?；咸烟蔷哂芯徑庖葝u素抵抗、減少胰島淀粉樣多肽、模擬胰島素和刺激葡萄糖轉運等作用，可作為治療糖尿病的先導化合物的候選化合物之一[22]；鞣花酸可能通過改善糖尿病小鼠肝臟胰島素信號通路和促進肝臟自噬流來改善糖尿病小鼠肝臟自噬障礙等機制來達到降糖保肝作用[23]，此外，鞣花酸可能通過下調TXNIP、IL-1β炎癥信號和抑制凋亡來改善糖尿病小鼠胰腺[24]，說明鞣花酸是潛在的抗糖尿病的化合物[25]；胡桃醌可抑制人肝癌HepG2 細胞增殖，促進細胞周期阻滯和凋亡[26]。由此可見，鞣花酸、五沒食子酰葡萄糖和胡桃醌可能是核桃仁干預2 型糖尿病的主要活性成分。

2.4 PPI 蛋白互作網絡

不同的靶點和信號通路之間會存在一定程度的信號轉導，藥物的治療作用除表現(xiàn)為成分靶點的直接結合外，更多見于直接調控靶點與間接調控其他靶點相結合的調控方式，研究蛋白之間的相互作用網絡，有助于挖掘核心的調控基因。將藥物靶點與疾病靶點的28 個交集靶點導入STRING 數據庫進行PPI 蛋白互作網絡，結果如圖2，網絡中包含28 個節(jié)點，77 個邊數，平均節(jié)點數5.5，根據拓撲學分析，DC、EC、BC 和CC 的中位數分別是：1、0.0396、0、0.351，取DC、EC、BC、CC 大于其2 倍中位數進行關鍵節(jié)點篩選，得到PPI 網絡圖的關鍵節(jié)點[27]，該網絡的關鍵節(jié)點(節(jié)點數≥5)包括PRKD1、PRKCA、PRKCB、PRKCE、PRKCZ、PRKCG、IL5、DUOX2、F2、CAT、G6PD、SOD、PTGS2、MMP2、MMP9、ESR1、VEGFA、AR、FASN、IGF2，這些關鍵靶點起到連接其它蛋白的重要作用，且可能是核桃仁干預2 型糖尿病的靶蛋白。

圖1 核桃仁-活性成分-疾病-靶點網絡Fig.1 Walnut kernel-active ingredient-disease-target network

圖2 藥物-疾病靶標相互作用圖Fig.2 Drug-disease target interaction diagram

2.5 核桃仁干預2 型糖尿病的GO 功能富集

將交集靶點基因在STRING 數據庫進行GO 生物過程富集，篩選到p＜0.05 的GO 生物過程432 條，GO分子功能過程49 條，GO 細胞成分過程6 條。GO 生物過程按p 值從小到大排前20 的結果（見圖3a）依次為：對有機物的應答、對刺激應答的正向調控、對含氧化合物的應答、對胞內信號轉導的調節(jié)、對有機物的細胞應答、對細胞通信的正向調節(jié)、信號的正向調節(jié)、對化學刺激的細胞應答、對信號轉導的正向調節(jié)，以及對生物加工的正調控、對細胞加工的正調控、細胞增殖的正調控、轉運方面的調節(jié)、DNA 結合轉錄因子活性的正調控、有機氮化合物代謝加工、蛋白磷酸化正調控、定位調控等。

GO 分子功能注釋結果按照p 值從小到大排前20的結果（見圖3b）依次為：蛋白激酶C 活性、催化活性、鈣依賴性蛋白激酶C 活性，離子結合、絲氨酸型內肽酶活性、抗氧化活性、蛋白結合、醇基作為受體的磷酸轉移酶活性、鋅結合、組氨酸激酶活性、激酶活性、標識蛋白結合、作用于蛋白的催化活性、信號受體結合、過氧化物酶活性、NADP（輔酶II）結合、氧化還原酶活性等。GO細胞組分注釋結果按照P值從小到大排前的結果（見圖3c）包括：胞外間隙、質膜、細胞外區(qū)部分、細胞外基質和內膜系統(tǒng)。

圖3 核桃仁干預2 型糖尿病的GO 注釋Fig.3 GO function annotation of walnut kernel intervention 2 diabetes

以上結果表明，糖尿病發(fā)病涉及多個體內生物過程的異常，同時說明核桃仁中的多個成分參與了多個體內生物過程來共同干預糖尿病的發(fā)生。核桃含有萘醌及其苷類、黃酮及其苷類等化合物，具有抗氧化、延緩衰老、降低血液黏度、防止血栓形成等多種生物學功能[11,28]，這與本研究的GO 功能分析結果顯示細胞對含氧化合物的反應、過氧化氫代謝過程及生物合成等過程有關。

2.6 核桃仁干預2 型糖尿病的KEGG 信號通路分析

將交集靶點導入STRING 數據庫中篩選出p＜0.05的信號通路86 條及其相關靶標，按p值從小到大排列的主要信號通路注釋及其相關靶標見圖4。直接參與糖尿病相關的通路有9 條：AGE-RAGE（糖尿病并發(fā)癥中的糖基化終末產物受體）信號通路、MAPK（腺苷酸激活蛋白激酶）信號通路、胰島素抵抗、胰島素分泌、PI3K-Akt（肌醇磷脂激酶-蛋白激酶）信號通路、胰腺分泌、2 型糖尿病、胰島素信號通路、碳代謝，參與循環(huán)系統(tǒng)相關信號通路4 條：VEGF（血管內皮生長因子）信號通路、HIF-1（hypoxia inducible factor-1，缺氧誘導因子-1）信號通路、cGMP-PKG（環(huán)磷鳥苷-蛋白激酶G）信號通路、血管平滑肌收縮；內分泌相關的通路2 條：促性腺激素（GnRH）信號通路、雌激素（Estrogen）信號通路；炎癥相關通路2 條：IL-17信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、自然殺傷細胞介導的細胞毒性；信號傳導相關的通路4 條：VEGF 信號通路、松弛素信號通路、單體GTP 結合蛋白Ras 信號通路、HIF-1 信號通路；癌相關通路3 條：膀胱癌、肝細胞癌、癌相關MicroRNA；甲狀腺相關通路2 條：甲狀腺激素合成、甲狀腺激素信號通路；神經遞質通路3 條：膽堿能突觸、谷氨酸能突觸、血清素神經突觸及與血清素代謝有關的色氨酸代謝；另有與氧化應激相關的谷胱甘肽代謝等信號通路。

由圖4 可知，RKCE、PRKCZ等靶點參與2 型糖尿病信號通路，IGF2、PRKCA、PRKCB、PRKCG和VEGFA等靶點參與MAPK 信號通路，MMP2、PRKCA、PRKCB、PRKCE、PRKCZ和VEGFA等靶點參與糖尿病并發(fā)癥的AGE-RAGE 信號通路，IGF2、PRKCA和VEGFA等靶點參與PI3K-Akt 信號通路，PRKCB、PRKCE和PRKCZ等靶點參與胰島素抵抗通路，IL5、MMP9和PTGS2等靶點參與IL-17 信號通路，MMP9和PTGS2參與腫瘤壞死因子信號通路。由此可見核桃仁可能是通過調控PRKCA、PRKCB、PRKCE、PRKCZ、IGF2、IL5、MMP9和PTGS2等靶點參與2 型糖尿病信號通路、MAPK 信號通路、PI3K-Akt 信號通路等信號通路達到干預2 型糖尿病的作用。

PPI 網絡圖發(fā)現(xiàn)PRKD1、PRKCA、PRKCB、PRKCE、PRKCZ、IL5、F2、CAT、G6PD等靶點是蛋白互作的關鍵蛋白，起到連接其它蛋白的重要作用，通過KEGG 富集分析結果發(fā)現(xiàn)這些關鍵靶蛋白參與糖尿病、癌癥、循環(huán)系統(tǒng)、炎癥等四大類17 條相關通路及其他內分泌、信號傳導、甲狀腺和神經遞質相關通路中。本研究發(fā)現(xiàn)與糖尿病相關通路主要是糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、MAPK 信號通路、胰島素抵抗、胰島素分泌、PI3K-Akt 信號通路、2 型糖尿病、胰島素信號通路和谷胱甘肽代謝等相關通路。AMPK 是生物能量代謝調節(jié)的關鍵分子，可以調節(jié)脂肪酸氧化和線粒體功能，促進葡萄糖轉運蛋白GLUT4轉運到質膜，增加葡萄糖攝取，是研究糖尿病及其他代謝相關疾病的核心[29,30]。胰島素是機體內唯一降血糖的激素，胰島素信號通路是一條很重要的2 型糖尿病通路，對糖尿病的發(fā)展非常重要[31]。由此可見， 核桃仁活性成分可能通過PRKD1、PRKCA、PRKCB、PRKCE、PRKCZ、IL5、F2、CAT、G6PD等多靶點參與MAPK 信號通路、AGE-RAGE 信號通路、胰島素抵抗和PI3K-Akt 信號通路等多條信號通路調節(jié)脂質代謝，從而實現(xiàn)干預2 型糖尿病的作用。

圖4 核桃仁干預2 型糖尿病的KEGG 主要信號通路注釋及其相關靶點Fig.4 Annotated diagram of KEGG main related signal pathways and targets of walnut kernel in type 2 diabetes

3 結論

本研究應用薈萃分析方法篩選出沒食子酸、沒食子單寧、五沒食子酰葡萄糖、木麻黃素及胡桃醌等11個核桃仁活性成分及其83 個潛在靶點，與糖尿病靶點交集的有28 個靶點，其中鞣花酸和五沒食子酰葡萄糖分別作用于前列腺素G/H 合酶2 和蛋白激酶等8 個靶點，胡桃醌作用于葡萄糖6 磷酸脫氫酶1 等6 個靶點，蛋白激酶α、β、ε等靶點同時受euprostin A 和9-環(huán)丙基壬酸甲酯等活性成分所作用，凝血因子II 和X 等靶點同時受沒食子單寧、9-環(huán)丙基壬酸甲酯等成分作用，體現(xiàn)了核桃仁多成分、多靶點協(xié)同干預2 型糖尿病的作用機制[2]。