張艷軍，李靖，張玉領(lǐng)，韓永紅，陳二華

（江蘇護理職業(yè)學院藥學與中藥學院，江蘇淮安 223005）

糖尿病是危害人類健康的三大慢性疾病之一，其中85%為2 型糖尿病，2 型糖尿病是由胰島素調(diào)控葡萄糖代謝能力下降（胰島素抵抗）伴隨胰島β 細胞功能缺陷所導(dǎo)致的胰島素分泌減少（或相對減少）為病理生理學特征的代謝性疾病[1]。糖尿病患者長期高血糖引起的并發(fā)癥對患者生活質(zhì)量和生存造成嚴重危害，因此，有效控制血糖水平、預(yù)防并發(fā)癥的發(fā)生具有重要意義[2]。合理膳食可以降低2 型糖尿病風險20%[3]，減少糖尿病患者慢性并發(fā)癥的發(fā)生，因此常見食物的降糖作用及降糖成分已成為糖尿病飲食和輔助治療研究的熱點之一。

黃秋葵[Abelmosehus eseuIentuss (L.) Moeneh]又名Okra、秋葵等，是原產(chǎn)于非洲熱帶地區(qū)的錦葵科秋葵屬草本植物，現(xiàn)在我國南北方各地均有栽培。黃秋葵的幼嫩莢果是百姓餐桌上常見的保健蔬菜，《本草綱目》記載，黃秋葵的根、莖、花、果實、種子等均可入藥，其根利水消腫，治肺熱咳嗽；種子補脾健胃，治消化不良；全株清熱解毒，潤燥滑腸等[4]。黃秋葵果實含有豐富的蛋白質(zhì)、游離氨基酸、礦物質(zhì)及由果膠和多糖等組成的黏性物質(zhì)，具有降血糖[5]、降血脂[6]、抗疲勞、抗氧化[7]等保健作用。黃秋葵中多糖成分含量約占2%[8]，植物多糖是普遍存在于天然植物中的聚糖，具免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗輻射、抗菌抗病毒、保護肝臟等保健作用[9]，目前研究表明黃秋葵多糖具有抗氧化[10]，抗疲勞[11]、抗腫瘤[12]、免疫調(diào)節(jié)[13]等方面的生物活性，但黃秋葵多糖對糖脂代謝的影響及對糖尿病大鼠腎臟病理的影響未見報道。

本實驗采取緩凍協(xié)同微波輔助提取方法提取黃秋葵多糖，采用鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型，通過黃秋葵多糖對空腹血糖、糖化血紅蛋白和對α-葡萄糖苷酶活性的影響，研究黃秋葵多糖的降血糖作用，同時通過黃秋葵多糖對血脂的影響和對腎臟組織病理改變的影響，研究黃秋葵多糖在調(diào)節(jié)糖尿病患者脂質(zhì)代謝紊亂的作用和對腎臟組織的保護作用，為黃秋葵多糖的降血糖及預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的藥用功能的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD 大鼠，南京醫(yī)科大學；黃秋葵果實，江蘇省淮安市景臺農(nóng)業(yè)生態(tài)園；對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG），美國Sigma 公司；α-葡萄糖苷酶，美國Sigma 公司；谷胱甘，上海藍季科技發(fā)展有限公司；阿卡波，德國拜耳醫(yī)藥保健有限公司；鹽酸二甲雙胍，上海施貴寶制藥有限公司；鏈脲佐菌素（STZ），美國Sigma 公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸鈉均為分析純。

1.2 儀器設(shè)備

LGJ-18 冷凍干燥機，北京松源華興生物技術(shù)有限公司；NJL07-3 型實驗用微，南京杰全微波設(shè)備有限公司；DZKW-S-8 恒溫水浴，蘇州江東精密儀器有限公司；DX-30B 小型實驗用粉粹機，廣州市大祥電子機械設(shè)備有限公司；TGL-10C 離心機，上海精密儀器儀表有限公司；血糖測試儀，三諾生物傳感股份有限公司；AC6601 型全自動糖化血紅蛋白分析儀，江蘇奧迪康醫(yī)學科技股份有限公司；AU5800 全自動生化分析儀，貝克曼庫爾特有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃秋葵多糖的提取

黃秋葵多糖的提取采用緩凍協(xié)同微波輔助提取工藝，取黃秋葵果實，純化水清洗干凈，冷凍干燥，粉粹過篩（60 目），3 倍體積石油醚脫脂，揮干溶劑，黃秋葵粉與去離子水按照液料比40:1（mL?g）混合，在60 ℃水浴浸提2.2 h，然后在-20 ℃環(huán)境下冷凍16 h，310 W 功率下微波處理，提取液加入等體積sevage 試劑（三氯甲烷/正丁醇4:1），充分振搖后靜置，4000 r?min離心10 min，取上清液，加入3 倍體積95%乙醇溶液，4 ℃沉淀過夜，離心，沉淀物依次用70%乙醇溶液、95%乙醇溶液、無水乙醇洗滌，干燥即得黃秋葵多糖。

1.3.2 T2DM 大鼠模型的建立

取SD 大鼠60 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，給予高脂高糖食物喂養(yǎng)7 d，隨后空腹12 h，腹腔一次注射45 mg/kg STZ，分別在3 d 和7 d 尾部采血，用血糖儀測定空腹血糖，2 次血糖值均在11.1 mmol/L 即為造模成功[14]。

1.3.3 動物分組及處理

取60 只T2DM 大鼠隨機分為6 組，分別為空白對照組、模型組、二甲雙胍對照組、黃秋葵多糖低、中、高劑量組。二甲雙胍對照組每日給予300 mg/kg鹽酸二甲雙胍灌胃，黃秋葵多糖低、中、高劑量組分別每日給予100、200、400 mg/kg 黃秋葵多糖灌胃?？瞻讓φ战M和模型組給與等量生理鹽水，持續(xù)4 周，期間大鼠自由飲水、飲食和活動。每隔7 d，尾部采血，測定空腹血糖。末次給藥后，禁食不禁水12 h，腹動脈采血處死大鼠，分離血清，采用糖化血紅蛋白分析儀測定糖化血紅蛋白（HbA1c），全自動生化分析儀測定總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）等生化指標，另取腎臟，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。制備3 μm 石蠟切片，采用蘇木素-伊紅（HE）染色評估腎臟病理改變。

1.3.4 黃秋葵多糖對α-葡萄糖苷酶活性的影響

反應(yīng)體系為67 mmol/L 磷酸鉀緩沖液（37 ℃，pH值6.80）860 μL，1 mg/mL 谷胱甘肽溶液25 μL，2.74 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液35 μL，與黃秋葵多糖（2、6、10 mg/mL）10 μL，阿卡波糖（2、6、10 mg/mL）10 μL；混勻，37 ℃恒溫10 min，加入15 mmol/LpNPG 溶液60 μL，繼續(xù)恒溫10 min，加入0.1 mol/L 碳酸鈉溶液4 mL，于波長400 nm 處測定吸光度（A）。α-葡萄糖苷酶管不加多糖，樣品空白管除不加pNPG 外其余同樣品管，空白管不加pNPG，其余用等體積的純化水補充[15]。

式中，A酶：α-葡萄糖苷酶管的吸光度；A樣：多糖樣品管的吸光度；A樣空：樣品空白管的吸光度；A空：空白管的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)均采用±s表示，采用SPSS17.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，p＜0.05 代表差異顯著，p＜0.01 代表差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃秋葵多糖對T2DM 大鼠血糖水平的影響

大鼠連續(xù)灌胃給藥4 w 后，空白組大鼠空腹血糖值為5.56 mmol/L，模型組和各給藥組血糖值與空白組比較顯著增高（p＜0.01）。模型組血糖值為23.54 mmol/L，黃秋葵多糖低劑量組血糖值為22.78 mmol/L，與模型組差異不顯著（p＞0.05），黃秋葵多糖中、高劑量組血糖值較模型組分別降低了26.17%和32.80%（p＜0.01）。灌胃給藥二甲雙胍4 w 后，大鼠血糖值為15.54 mmol/L，黃秋葵多糖高劑量組血糖值為15.82 mmol/L，與二甲雙胍組比較無顯著性差異（p＞0.05），黃秋葵多糖低、中劑量組血糖值顯著高于二甲雙胍組（p＜0.05）。由此可以看出，黃秋葵多糖中、高劑量組能夠明顯降低糖尿病大鼠的血糖值，且存在劑量依賴性，高劑量組效果最好，該結(jié)果與Tomoda 和Fan 研究黃秋葵具有降血糖作用的結(jié)果相一致[16,17]。

表1 黃秋葵多糖對糖尿病大鼠血糖水平的影響Table 1 Effect of okra polysaccharide on blood glucose in diabetic rats

2.2 黃秋葵多糖對α-葡萄糖苷酶活性的影響

研究表明，餐后高血糖比空腹高血糖更易導(dǎo)致微血管和大血管并發(fā)癥[18]，α-葡萄糖苷酶抑制劑的降糖機制是通過抑制小腸黏膜上的α-葡萄糖苷酶的活性，降低寡糖的分解速率，使碳水化合物的消化過程向小腸底部延伸，從而延遲葡萄糖進入血液，降低葡萄糖的總吸收率而降低血糖，對餐后高血糖的作用比較明顯，是降低餐后血糖升高的最佳策略之一，并且有助于避免晚期糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生[19]。葡萄糖苷酶抑制劑不刺激胰島素的分泌，單獨使用本類藥物通常不會引發(fā)低血糖，因此有助于減少血糖的波動。目前臨床常用的α-葡萄糖苷酶抑制劑有阿卡波糖、伏格列多糖等，阿卡波糖是從放線菌的次生代謝產(chǎn)物分離出來的α-葡萄糖苷酶抑制劑，對控制餐后血糖的升高有顯著療效，是臨床餐后高血糖患者的首選藥物[20]。

表2 黃秋葵多糖對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Table 2 The inhibitory effect of okra polysaccharide on α-glucosidase

黃秋葵多糖對α-葡萄糖苷酶活性的實驗結(jié)果如表2 所示，黃秋葵多糖對α-葡萄糖苷酶有明顯的抑制作用，且具有劑量依賴性，隨著濃度的增加抑制率明顯增強，在10 mg/mL 下，抑制率達到68.26%。但同等質(zhì)量濃度下，黃秋葵多糖對α-葡萄糖苷酶抑制率要低于阿卡波糖，且差異顯著（p＜0.01），可能是由于黃秋葵多糖成分復(fù)雜，對α-葡萄糖苷酶抑制作用的多糖成分有待進一步分離純化，從而在同等質(zhì)量濃度下影響了抑制率。試驗結(jié)果表明，黃秋葵多糖對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制活性，可開發(fā)為具有降糖功效的膳食補充劑或保健食品，也可通過進一步研究開發(fā)成為新的降糖藥物。

2.3 黃秋葵多糖對T2DM 大鼠糖化血紅蛋白的影響

HbA1c 是高血糖作用下由葡萄糖的游離醛基與血紅蛋白A(HbA)的β鏈N 末端纈氨酸的氨基經(jīng)非酶促結(jié)合反應(yīng)生成的產(chǎn)物，其含量主要取決于血糖濃度及血糖與血紅蛋白的接觸時間，可以反映測定前120 d的平均血糖水平[21,22]。HbA1c 是預(yù)測糖尿病發(fā)生的更為有效的預(yù)測因子[23]，是監(jiān)測糖尿病患者血糖控制的主要手段，被提倡用作T2DM 的診斷工具[24]。2011年WHO建議在條件具備的國家和地區(qū)采用HbA1c 診斷糖尿病，診斷切點為HbA1c≥6.5%[25]。因此在糖尿病臨床治療中，HbA1c 水平對評價血糖總體控制、療效考核、發(fā)現(xiàn)治療中存在的問題以及指導(dǎo)治療方案均有重要的臨床意義，HbA1c 作為評估糖尿病補償和治療的金標準，也是診斷和管理糖尿病的重要手段[26]。

大鼠連續(xù)灌胃給藥4 w 后，黃秋葵多糖中、高劑量組大鼠HbA1c 含量分別是11.56%和10.48%，與模型組 12.76%相比分別降低了 9.40%和 17.87%（p＜0.01），多糖低劑量組與模型組差異不顯著（p＞0.05）。二甲雙胍組大鼠HbA1c 含量為10.24%，多糖低、中劑量組顯著高于二甲雙胍組（p＜0.01），高劑量組與二甲雙胍組無顯著差異，以上結(jié)果表明，黃秋葵多糖能夠顯著降低糖尿病大鼠的糖化血紅蛋白的水平，有效調(diào)節(jié)和改善糖代謝水平，對控制和預(yù)防糖尿病具有重要意義，且多糖高劑量組效果比較明顯。

表3 黃秋葵多糖對糖尿病大鼠糖化血紅蛋白的影響Table 3 Effect of okra polysaccharide on glycated hemoglobin in diabetic rats

2.4 黃秋葵多糖對T2DM 大鼠血脂的影響

胰島素能夠促進肝合成脂肪酸，抑制脂肪酶的活性，減少脂肪的分解。2 型糖尿病患者由于胰島素的生物調(diào)節(jié)作用發(fā)生紊亂，在血糖升高的同時，常伴有血脂代謝異常，主要表現(xiàn)為血清總膽固醇TC、極低密度脂蛋白VLDL 水平升高，高密度脂蛋白HDL 水平下降，持續(xù)性餐后高脂血癥以及LDL 水平輕度升高[27]。脂代謝異常既影響糖尿病及其并發(fā)癥的原發(fā)性病理生理過程，又是其病理生理過程中起決定作用的重要因素。脂代謝紊亂與糖代謝紊亂互相影響，是引起糖尿病血管病變的重要危險因素，也是導(dǎo)致并發(fā)癥主要原因[28]。循證醫(yī)學研究表明，降低總膽固醇（TC）和LDL 水平能夠顯著降低糖尿病患者發(fā)生大血管病變和死亡風險[29]。

T2DM 大鼠在黃秋葵多糖的干預(yù)下，血脂代謝發(fā)生了變化，結(jié)果如表4 所示，大鼠連續(xù)灌胃給藥4 w后，糖尿病模型組大鼠的TC、TG、LDL 均明顯高于正常對照組，且差異顯著（p＜0.05），HDL 與正常對照組比較差異不顯著（p＞0.05）。與糖尿病模型組比較，黃秋葵高劑量組TC、TG、LDL 分別降低了21.55%、38.98%、40.70%（P＜0.05），HDL 升高了47.46%（p＜0.01），黃秋葵中劑量組TG、LDL 明顯低于糖尿病模型組（p＜0.05），HDL 明顯高于糖尿病模型組（p＜0.05），黃秋葵低劑量組TG 明顯低于糖尿病模型組，HDL 明顯高于糖尿病模型組，這與張靈敏等的研究結(jié)果一致，黃秋葵能夠顯著降低2 型糖尿病大鼠的血脂水平[30]，其機制主要通過上調(diào)CYP7A1 以促進膽固醇代謝，下調(diào)SREBP1c 和FAS 抑制脂質(zhì)合成[31]。以上結(jié)果表明，黃秋葵多糖能降低糖尿病大鼠的TC、TG、LDL，提高HDL 水平，調(diào)節(jié)2 型糖尿病大鼠的脂質(zhì)代謝，有助于預(yù)防糖尿病的并發(fā)癥的發(fā)生。

表4 黃秋葵多糖對T2DM 大鼠血脂代謝的影響Table 4 Effect of okra polysaccharide on serum lipid in T2DM rats

2.5 黃秋葵多糖對T2DM 大鼠腎組織病理改變的影響

圖1 黃秋葵多糖對T2DM 大鼠腎臟的影響Fig.1 Effect of okra polysaccharide on kidney in diabetic rats

腎損傷是糖尿病最主要的并發(fā)癥之一，中藥在糖尿病及其并發(fā)癥的防治上發(fā)揮了重要作用，近年研究顯示中藥提取物可部分減輕糖尿病引起的腎損傷[32]。資料表明，黃芪多糖可緩解糖尿病動物模型的炎癥反應(yīng)，改善胰島功能、降低血糖水平，通過抑制大鼠腎臟TGF-β1/Smad 信號通路，改善糖尿病引起腎臟等臟器損傷[33,34]。

黃秋葵多糖對T2DM 大鼠腎臟的影響如圖1 所示，從腎臟病理圖片可以看出，T2DM 模型組出現(xiàn)明顯的腎小球萎縮，彌漫性小管擴張，皮髓區(qū)的血管周圍和部分小管間散在炎癥細胞浸潤，部分腎小管腫脹，上皮部分出現(xiàn)空泡變和脫落，而黃秋葵多糖各劑量組不同程度的改善T2DM 大鼠腎小球萎縮、腎小管擴張腫脹。結(jié)果表明，黃秋葵多糖能夠改善T2DM 大鼠的腎臟病理病變，減少腎小球及腎小管病變，從而改善糖尿病對腎的損害。

3 結(jié)論

黃秋葵是百姓日常生活中常見的具有營養(yǎng)功能的蔬菜，且已被研制成秋葵飲料、秋葵泡菜、秋葵茶、秋葵脆等特色的食品，黃秋葵多糖是其營養(yǎng)與保健功能的主要成分。本實驗通過鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型，喂養(yǎng)黃秋葵多糖4 周后，血糖測定結(jié)果顯示，黃秋葵多糖中、高劑量組能夠明顯降低糖尿病大鼠的空腹血糖值，高劑量組效果最好。此外通過體外對α-葡萄糖苷酶活性試驗，黃秋葵多糖能夠顯著抑制α-葡萄糖苷酶的活性。同時黃秋葵多糖能降低糖尿病大鼠的TC、TG、LDL，提高HDL 水平，明顯改善2 型糖尿病大鼠的脂質(zhì)代謝紊亂，并且改善T2DM 大鼠腎臟病變，因此黃秋葵多糖可開發(fā)成降糖膳食補充劑或保健食品，具有廣闊的應(yīng)用價值和市場前景，但黃秋葵多糖在降低血糖血脂及改善腎臟病變的機制方面還有待進一步的研究。