劉淑敏，孫嘉蔚，陳小丹，潘毅，王標(biāo)詩

（嶺南師范學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東湛江 524048）

隨著人類生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)、生活方式的轉(zhuǎn)變，高脂血癥（hyperlipoidemia，HLP）已經(jīng)成為威脅現(xiàn)代人健康的十大隱形殺手之一[1]。當(dāng)體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，過高的脂質(zhì)會在位于脂質(zhì)代謝中心環(huán)節(jié)的肝臟細胞內(nèi)堆積，發(fā)生脂肪變性[2,3]。非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是以肝細胞脂肪變性及脂質(zhì)蓄積為特征的肝臟疾病，大量臨床和動物實驗證實其發(fā)生與高脂血癥密切相關(guān)[4-6]，其最明顯的特點就是細胞內(nèi)甘油三酯（triglycerides，TG）含量的顯著升高[7,8]。鑒于目前沒有直接評價生物活性物質(zhì)降血脂能力的離體細胞模型，研究其對NAFLD的預(yù)防和治療作用成為越來越多研究者評價生物活性物質(zhì)降血脂能力的選擇[9,10]。NAFLD 細胞模型建立常用的誘導(dǎo)劑包括軟脂酸、油酸、高濃度胎牛血清和脂肪乳，所用細胞通常為人肝癌細胞株（liver cancer cell line，HepG2）、人正常肝細胞（human liver cell line，L02 ） 、 小 鼠 3T3-L1 前 脂 肪 細 胞（ mouse 3T3-L1preadipocytes）等[11,12]。其中，L02 細胞實驗結(jié)果更接近于正常肝細胞發(fā)展而來的NAFLD 在體模型特點，是體外脂質(zhì)代謝調(diào)控研究較為理想的模型[13]。

相較于化學(xué)類降血脂藥物，以天然植物及其有效成分為原料開發(fā)的降血脂藥物，具有毒副反應(yīng)少、作用溫和、可長期服用等優(yōu)點。山茱萸（Cornus officinalis Sieb. et Zucc.）是我國常見的藥食兩用型中藥材，馬錢苷（Loganin）是山茱萸主成分環(huán)烯醚萜苷類的主要效應(yīng)成分，研究表明其具有抑制神經(jīng)退行性病變[14]、降血糖[15]、抗炎[16]、抗血栓[17]等作用，但是對其是否能夠降血脂尚無報道。

本實驗以馬錢苷為原料，通過高濃度胎牛血清誘導(dǎo)人肝L02 細胞發(fā)生脂肪變性，研究了馬錢苷對細胞脂肪變性的抑制作用，初步探討了馬錢苷的細胞降血脂效果和作用機制。實驗結(jié)果有助于揭示和闡明馬錢苷的降血脂效果和相關(guān)機理，為馬錢苷相關(guān)降血脂保健品和藥物等的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬錢苷（≥98%），成都曼思特生物科技有限公司；人正常肝細胞（human livercell line，L02），中山大學(xué)腫瘤研究所；高糖DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium）培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶溶液、PBS（phosphate-buffered saline）緩沖液（pH 7.4）、6 孔和96 孔細胞培養(yǎng)板，美國Gibco 公司；胎牛血清（heat-inactivated fetal bovine serum, FBS），杭州四季青生物工程材料有限公司；雙抗（青霉素-鏈霉素溶液，100X）、噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、曲拉通（Triton X-100），碧云天生物技術(shù)研究所；總蛋白定量測試盒、油紅O 檢測試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）測試盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）測試盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測試盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒、甘油三酯（triglycerides，TG）測定試劑盒、微量丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒，南京建成生物工程研究所。

Varioskan Flash 熒光酶標(biāo)儀、Hepa Class 100 CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo 公司；BX51 倒置熒光顯微鏡，日本Olympus 光學(xué)工業(yè)株式會社；XW-80A 旋渦混合器，上海精科實業(yè)有限公司；BSA124S-CW 電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；THZ-C 臺式恒溫振蕩器，蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；JW-3021 HR 高速冷凍離心機，安徽嘉文儀器裝備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及模型建立

采用本實驗室已經(jīng)報道的方法[18]進行。L02 細胞常規(guī)培養(yǎng)于DMEM 正常培養(yǎng)基（含10% FBS 和1%雙抗）中，并置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞密度長至約瓶壁80%時，取對數(shù)生長期細胞于6 孔板（2 mL/孔，接種濃度1×105個/mL）或96孔板（100 μL/孔，接種濃度5×104個/mL）上，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，棄培養(yǎng)基，分成以下8 組：正常組、模型組、自然恢復(fù)組、馬錢苷對照組（150 μmol/L）、藥物對照組（辛伐他汀，50 μmol/L）、馬錢苷處理組（包括馬錢苷低、中、高劑量組，濃度分別為50、100、150 μmol/L）。正常組與馬錢苷對照組于正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其余組于高FBS 培養(yǎng)基（含50%FBS 和1%雙抗）中培養(yǎng)，以構(gòu)建脂肪變性細胞模型。24 h 后，棄培養(yǎng)基，正常組與自然恢復(fù)組加入正常培養(yǎng)基，馬錢苷處理組和馬錢苷對照組加入含馬錢苷的正常培養(yǎng)基，藥物對照組加入含辛伐他汀的正常培養(yǎng)基，模型組加入高FBS 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 MTT 法檢測細胞增殖抑制率

取分組培養(yǎng)后的96 孔板，棄上清液，每孔加入20 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，棄上清液并在每孔中加入100 μL DMSO，37 ℃震蕩10 min 后，酶標(biāo)儀于570 nm 處測定吸光度OD 值，按下式計算細胞增殖抑制率：

1.2.3 油紅O 染色觀察增殖抑制效果

6 孔板預(yù)先覆蓋無菌蓋玻片，按照1.3.1 操作處理后，取出無菌蓋玻片，PBS 沖洗2 次后，按照油紅O檢測試劑盒說明書操作進行染色、復(fù)染、封片，然后置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。采用Image Pro Plus 6.0 軟件對圖片進行分析。

1.2.4 細胞上清液指標(biāo)測定

取分組培養(yǎng)后的6 孔板，收集細胞上清液，按照相應(yīng)測試盒說明書操作，采用酶標(biāo)儀檢測上清液中AST、ALT 和LDH 酶泄漏量以及TC 和TG 水平。酶泄漏量測定結(jié)果以每升上清液中含有的酶活力單位量（U/L）表示，TC 和TG 測定結(jié)果以每分升上清液中含量（mg/dL）表示。

1.2.5 細胞內(nèi)指標(biāo)測定

用PBS 清洗收集上清液后的6 孔板，加入0.25%胰蛋白酶（1 mL/孔），消化并收集細胞。收集后的細胞用PBS 清洗，離心后加入1.5% Triton X-100（200 μL，PBS 配制），于4 ℃裂解30 min，得到細胞裂解液。按照相應(yīng)測試盒說明書操作，采用酶標(biāo)儀檢測裂解液中TC 和TG 水平以及硫代巴比妥酸反應(yīng)物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）含量。TC 和TG 測定結(jié)果以每分升裂解液中含量（mg/dL）表示，TBARS含量采用MDA 測試盒測定，測定結(jié)果以每升裂解液中MDA 摩爾質(zhì)量當(dāng)量（mmol MDA eq/L）表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)至少3 次重復(fù)，實驗結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用Origin 9.0 軟件作圖，SPSS 17.0 軟件的One-Way ANOVA 進行單因素方差分析，LSD 檢驗進行顯著性分析（p＜0.05 時差異顯著，p＜0.01 時差異極顯著）。

2 結(jié)果與討論

2.1 馬錢苷對脂肪變性L02 細胞增殖的抑制作用

MTT 法測定的不同分組細胞增殖抑制結(jié)果如表1所示。由表可知，馬錢苷對照組與正常組OD 值無顯著差異（p>0.05），表明在實驗濃度范圍內(nèi)馬錢苷對L02 細胞無毒性作用。與模型組相比，馬錢苷處理組、辛伐他汀藥物對照組和自然恢復(fù)組均對脂變細胞增殖有明顯的抑制作用（p<0.05），抑制率分別為14.60%～26.91%、18.94%和12.15%。自然恢復(fù)組結(jié)果表明，脂肪變性是一種可逆性損傷，隨著時間延長，細胞具有一定的自然恢復(fù)能力，但是恢復(fù)效果遠弱于馬錢苷和藥物作用效果。馬錢苷高濃度組（150 μmol/L）對脂變細胞的增殖抑作用顯著高于藥物對照組（p<0.05），同濃度馬錢苷（50 μmol/L）的增殖抑制率略低于辛伐他汀，但無顯著差別（p>0.05）。馬錢苷中、高濃度處理組對脂變細胞的增殖抑制作用高于自然恢復(fù)組，且抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性關(guān)系，表明馬錢苷對脂變細胞增殖有一定的調(diào)控作用，能夠通過抑制脂肪肝細胞增殖，抑制細胞脂肪變性。

表1 馬錢苷對脂肪變性L02 細胞增殖的抑制作用Table 1 Inhibition effect of loganin against the growth of steatosis L02 cells

2.2 馬錢苷對脂肪變性L02 細胞胞漿內(nèi)脂滴累積的抑制作用

細胞胞漿內(nèi)脂滴累積的油紅O 染色結(jié)果如圖1 所示。由圖可知，正常組和馬錢苷對照組L02 細胞邊緣清晰，胞漿內(nèi)未見明顯的紅色脂滴。模型組細胞邊界棱角模糊，胞漿內(nèi)存在大量繞核分布的紅色脂滴，脂變幾乎累及所有細胞。通過Image Pro Plus 6.0 軟件對各組細胞平均光密度進行統(tǒng)計分析，結(jié)果如圖2 所示。由圖可知，與模型組相比，馬錢苷處理組、藥物對照組和自然恢復(fù)組細胞胞漿內(nèi)脂滴含量均有不同程度的減少，且馬錢苷中、高濃度處理組胞漿內(nèi)脂滴減少程度明顯高于自然恢復(fù)組（p<0.05）。馬錢苷處理組胞漿內(nèi)脂滴呈現(xiàn)劑量依賴性減少，表明馬錢苷能夠通過抑制脂肪肝細胞胞漿內(nèi)脂滴累積，抑制細胞脂肪變性。戴冰等[19]通過油紅O 染色法觀察了馬錢苷對大鼠前脂肪細胞分化過程中脂肪聚積的影響，結(jié)果表明，32 μmol/L 和16 μmol/L 馬錢苷各時段（48、72、96 h）均能顯著抑制大鼠前脂肪細胞分化過程中的脂肪聚積，同樣證實一定濃度的馬錢苷具有改善脂肪細胞分化異常，進而改善脂質(zhì)代謝紊亂的作用。王福興[20]利用高胰島素誘導(dǎo)HepG2 細胞建立胰島素抵抗模型，并采用馬錢苷（512 μmol/L）處理細胞，24 h 后通過異丙醇對細胞脂滴進行溶解并測定OD 值，結(jié)果表明，馬錢苷可以極顯著降低細胞脂滴含量（p<0.01），抑制細胞脂質(zhì)合成。以上研究結(jié)果與本文在馬錢苷處理濃度上差異較大，可能與所用模型以及處理時長有關(guān)。

圖1 馬錢苷對脂肪變性L02細胞胞漿內(nèi)脂滴累積的作用效果圖（×200）Fig.1 Effect of loganin on accumulation of lipid droplets in steatosis L02 cells

圖2 各組細胞油紅O 染色的平均光密度值統(tǒng)計分析Fig.2 Statistical analysis of the average optical density of cells stained by Oil Red O staining

2.3 馬錢苷對脂肪變性L02 細胞胞外AST、ALT 和LDH 酶活的影響

作為肝臟中重要的轉(zhuǎn)氨酶，谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）分別分布于肝細胞線粒體和胞漿內(nèi)，是臨床肝臟疾病診斷中常用的檢查項目[21]。乳酸脫氫酶（LDH）廣泛存在于人體所有組織細胞中，是人體組織和器官受損的標(biāo)志物，也是評價肝細胞受損的常用指標(biāo)[22]。當(dāng)肝細胞受損時，細胞膜通透性增加，AST、ALT 和LDH 泄露，導(dǎo)致上清液中這三種酶的酶活增加，且其泄露量隨肝細胞損傷的加重而增高[23]。不同分組細胞上清液中AST、ALT 和LDH 酶活結(jié)果如表2 所示。

由表2 可知，與正常組相比，模型組上清液中三種酶酶活均顯著升高（p<0.05），而馬錢苷對照組與正常組酶活無顯著差別（p>0.05），提示模型組對L02細胞造成損傷，而實驗濃度范圍內(nèi)馬錢苷對L02 細胞無損傷作用。與模型組相比，馬錢苷處理組三種酶酶活顯著下降（p<0.05），分別降低了26.70%～52.58%、24.83%～61.23%和14.53%～28.83%，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，且中、高濃度組下降水平顯著高于自然恢復(fù)組（p<0.05），表明馬錢苷可以通過劑量依賴性減少AST、ALT 和LDH 泄漏量而減少脂變引起的L02 細胞損傷。南美娟等[24]采用對乙酰氨基酚制備小鼠急性藥物性肝損傷模型，研究了山茱萸對小鼠的保肝作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山茱萸果肉、果核和全果提取物中高劑量組小鼠血清中AST、ALT 水平顯著均降低（p<0.05或p<0.01）。來麗娜等[25]研究了山茱萸不同活性部位對小鼠急性肝損傷的保護作用，結(jié)果表明，總甘部位血清ALT、AST 含量均顯著降低（p<0.05 或p<0.01），并呈劑量相關(guān)性。雖然目前尚無馬錢苷對細胞或動物模型AST、ALT 和LDH 酶活影響的研究報道，但作為山茱萸主成分環(huán)烯醚萜苷類的主要效應(yīng)成分，南美娟[24]和來麗娜等[25]的研究結(jié)果能夠從側(cè)面證實馬錢苷對轉(zhuǎn)氨酶酶活的影響。

2.4 馬錢苷對脂肪變性L02 細胞胞外和胞內(nèi)TC、TG 水平的影響

肝臟是機體脂肪代謝最重要的場所，一旦發(fā)生脂質(zhì)代謝紊亂，會導(dǎo)致肝臟中總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）過度蓄積，發(fā)生脂肪變性，誘發(fā)脂肪肝病發(fā)生，因此TC 和TG 含量變化可以直接反映肝臟的病變情況[26,27]。不同分組細胞內(nèi)外TC 和TG 水平結(jié)果如表3 所示。由表可知，與正常組相比，模型組細胞內(nèi)外TC 和TG 水平均顯著升高（p<0.05），提示高FBS進入細胞，使得L02 細胞功能紊亂，TC 和TG 蓄積增多。馬錢苷對照組與正常組無顯著差別（p>0.05），表明實驗濃度范圍內(nèi)馬錢苷不會造成L02 細胞功能紊亂。與模型組相比，馬錢苷處理組、藥物對照組和自然恢復(fù)組細胞內(nèi)外TC 和TG 水平均有不同程度的降低，但自然恢復(fù)組降低作用顯著弱于馬錢苷處理組和藥物對照組，表明脂變L02 細胞能夠自身逆轉(zhuǎn)并改善脂肪變性，但效果有限。隨著馬錢苷處理濃度的增加，脂變細胞內(nèi)外TC 和TG 水平逐漸降低，與模型組相比，胞外TC 和TG 水平分別下降50.46%～68.76%和32.51%～53.37%，胞內(nèi)TC 和TG 水平分別下降11.48%～32.79%和10.50%～18.30%，表明馬錢苷可以劑量依賴性減少脂變細胞中TC 和TG 的蓄積，改善L02 細胞脂質(zhì)沉積，改善肝臟病變情況，從而起到降血脂效果。王福興[20]研究結(jié)果也表明，馬錢苷（512 μmol/L）可以極顯著減少胰島素抵抗HepG2 細胞胞內(nèi)TC 和TG 含量（p<0.01）。劉洪等[28]以高脂飼養(yǎng)結(jié)合鏈脲佐菌素腹腔注射造模，觀察山茱萸環(huán)烯醚萜總苷（ICO）對2 型糖尿病心臟病變大鼠血脂含量的影響，結(jié)果表明，ICO 組大鼠TG、CHOL、LDL-C 含量均明顯降低（p<0.05 或p<0.01），提示ICO 能改善2 型糖尿病胰島素抵抗，調(diào)節(jié)血脂水平。以上研究報道提示馬錢苷對于細胞或動物TC 和TG 水平有很好的調(diào)節(jié)作用，與本實驗結(jié)果一致。

表2 馬錢苷對脂肪變性L02 細胞胞外AST、ALT 和LDH 酶活的影響Table 2 Effect of loganin on enzyme activities of AST, ALT and LDH in steatosis L02 cells

表3 馬錢苷對脂肪變性L02 細胞TC 和TG 水平的影響Table 3 Effect of loganin on levels of TC and TG in steatosis L02 cells

2.5 馬錢苷對脂肪變性L02 細胞胞內(nèi)TBARS水平的影響

硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS）是脂質(zhì)過氧化的終末產(chǎn)物，其含量直接反映細胞和組織脂質(zhì)過氧化的水平，而其中最重要的一種就是MDA[29,30]。以MDA為標(biāo)準(zhǔn)參照物，測定不同分組細胞內(nèi)TBARS 水平，實驗結(jié)果如圖3 所示。由圖可知，與正常組相比，模型組細胞內(nèi)TBARS 水平顯著升高（p<0.05），提示高FBS 進入細胞，對L02 細胞造成損傷，使其發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。馬錢苷對照組與正常組無顯著差別（p>0.05），表明實驗濃度范圍內(nèi)馬錢苷不會對L02細胞造成損傷。與模型組相比，馬錢苷處理組、藥物對照組和自然恢復(fù)組 TBARS 水平均顯著降低（p<0.05），分別下降40.33%～60.10%、38.66%和25.33%，但自然恢復(fù)組降低效果顯著弱于馬錢苷中高濃度處理組和藥物對照組，表明馬錢苷對脂變L02 細胞TBARS 水平的降低作用明顯高于細胞對脂質(zhì)過氧化損傷的自我修復(fù)作用。馬錢苷處理組TBARS 水平隨馬錢苷作用濃度的增加而減小，表明馬錢苷可以通過抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物TBARS 的生成，減少因脂質(zhì)過氧化而引起的細胞損傷。來麗娜等[25]研究表明，山茱萸總甘部位能夠顯著降低急性肝損傷小鼠肝組織勻漿中MDA 含量（p<0.05 或p<0.01），其保肝機制可能與抑制脂質(zhì)過氧化相關(guān)，與本實驗結(jié)果一致。

圖3 馬錢苷對脂肪變性L02 細胞TBARS 水平的影響Fig.3 Effect of loganin on levels of TBARS in steatosis L02 cells

3 結(jié)論

本文以馬錢苷為原料，以高濃度胎牛血清誘導(dǎo)人肝L02 細胞脂肪變性，研究了馬錢苷對細胞脂肪變性的抑制作用及相關(guān)作用機制。研究結(jié)果表明，馬錢苷可以劑量依賴性抑制脂變細胞增殖和胞漿內(nèi)脂滴累積，減少因脂肪變性引起的細胞外AST、ALT 和LDH泄露以及胞內(nèi)胞外TC 和TG 的蓄積，從而減少脂變引起的L02 細胞損傷。此外，還可以抑制脂變細胞內(nèi)TBARS 生成，減少因脂質(zhì)過氧化引起的細胞損傷。