劉 洋，鄭 茜，鄭秀芹，范 輝，陸 茵，王愛云，陳文星

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是指從實(shí)體惡性腫瘤原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶釋放進(jìn)入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的重要因素。腫瘤患者外周血中還存在團(tuán)簇形式的CTC，稱之為循環(huán)腫瘤細(xì)胞簇(circulating tumor cells clusters，CTC clusters)。Watanabe等最早在癌癥患者的外周血中證實(shí) CTC clusters 的存在，它是由兩個(gè)或者兩個(gè)以上的CTC聚集形成。研究發(fā)現(xiàn)，CTC clusters 比單個(gè)CTC具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力，其轉(zhuǎn)移能力比單個(gè)CTC高出23-50倍[1]。腫瘤的血行轉(zhuǎn)移是指腫瘤細(xì)胞在侵入血管后隨血液在循環(huán)中運(yùn)行并附著在遠(yuǎn)端血管內(nèi)皮的過程，在整個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞的血行轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，有的腫瘤細(xì)胞在腫瘤切除手術(shù)之前就發(fā)生了血行轉(zhuǎn)移則很大概率導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)。因此，探究循環(huán)腫瘤細(xì)胞簇的形成機(jī)制，限制其血行轉(zhuǎn)移能力或許可以減少腫瘤的復(fù)發(fā)，并為臨床治療腫瘤轉(zhuǎn)移提供新的依據(jù)。

1 CTC clusters的特征起源

腫瘤細(xì)胞在血液循環(huán)中的存在形式既有單個(gè)腫瘤細(xì)胞形式——即循環(huán)腫瘤細(xì)胞，也有團(tuán)簇形式——即循環(huán)腫瘤細(xì)胞簇，而不同的細(xì)胞形式所具有的轉(zhuǎn)移特性及能力也大不相同，CTC clusters屬于單克隆細(xì)胞群，以團(tuán)簇的形式從癌癥病灶脫落進(jìn)入血液循環(huán)[2]。

1.1 CTC clusters的結(jié)構(gòu)特性與單個(gè)CTC相比，CTC clusters在循環(huán)中運(yùn)行體積大、速度慢，容易在內(nèi)臟微血管滯留，CTC clusters的這些物理特性提高了腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)處器官發(fā)生定植的幾率[3]，被攔截下來的腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用形成腫瘤細(xì)胞的外滲。從物理生物學(xué)的角度研究，CTC clusters傾向于通過與E-鈣黏素相互作用發(fā)生邊緣化、旋轉(zhuǎn)和內(nèi)皮的黏附[4]。CTC團(tuán)簇的移動(dòng)速度遠(yuǎn)低于單個(gè)CTC，即使在直徑不足以攔截團(tuán)簇的血管中，也易于邊緣化和附著在血管壁上。此外，這種簇狀結(jié)構(gòu)還為其中的腫瘤細(xì)胞提供了特殊的微環(huán)境，并且該微環(huán)境根據(jù)簇的大小和組成而變化，細(xì)胞簇越大、連接越緊密，給腫瘤細(xì)胞提供的微環(huán)境更加低氧[5]，利于腫瘤細(xì)胞的生存。

近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)CTC clusters還存在可變形性，Au等[6]使用微流體裝置和斑馬魚模型，發(fā)現(xiàn)包含≤20個(gè)細(xì)胞的CTC團(tuán)簇能夠通過重組成單鏈狀幾何結(jié)構(gòu)而通過毛細(xì)血管，且這些CTC團(tuán)簇的形狀是高度可塑性的，在穿過毛細(xì)血管后，細(xì)胞能夠輕松地再次重組為球形簇，這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步加深了我們對(duì)基于CTC clusters的轉(zhuǎn)移的理解。

1.2 CTC clusters形成的分子機(jī)制血行轉(zhuǎn)移中CTC clusters的顯著特征是其表層具有血小板包被，但關(guān)于調(diào)控血小板黏附聚集形成細(xì)胞簇的分子機(jī)制卻少有報(bào)道，下面就幾種參與CTC clusters形成的關(guān)鍵蛋白進(jìn)行闡述。

1.2.1Podoplanin誘導(dǎo)血小板黏附聚集促進(jìn)CTC clusters形成 Podoplanin(PDPN)名為血小板聚集誘導(dǎo)因子Aggrus，也稱平足蛋白，是一種在多種腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)的I型跨膜粘蛋白樣糖蛋白，它可以通過與血小板相互作用并激活血小板受體C型凝集素樣受體-2(C-type lectin-like receptor 2，CLEC-2)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與血小板相互聚集形成CTC clusters，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移，有研究證明，抑制PDPN和CLEC-2受體的相互作用可以抑制CTC clusters的形成[7]。這些結(jié)果表明，PDPN可能通過促進(jìn)血小板激活、血小板-腫瘤細(xì)胞相互作用繼而促進(jìn)CTC clusters的形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移。

1.2.2Fibronectin促進(jìn)血小板與腫瘤細(xì)胞黏附和CTC Clusters形成 纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)是一種二聚體糖蛋白，廣泛參與細(xì)胞遷移、黏附以及止血等生理病理過程。血漿的FN在血液中循環(huán)，并且在組織損傷時(shí)，摻入纖維蛋白凝塊中以對(duì)血小板功能發(fā)揮作用并介導(dǎo)止血過程。FN在多種腫瘤中異常表達(dá)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和血管生成等有促進(jìn)作用[8]。FN是多種整合素受體的配體，在介導(dǎo)細(xì)胞黏附時(shí)，F(xiàn)N上的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列可識(shí)別細(xì)胞表面整合素異二聚體并與之結(jié)合，進(jìn)而影響細(xì)胞黏附、遷移等；在介導(dǎo)凝血過程中，F(xiàn)N與血小板整合素受體形成強(qiáng)力結(jié)合，促進(jìn)血小板的黏附聚集及其促凝血活性[9]。FN還可通過與腫瘤細(xì)胞表面整合素αvβ3、αvβ6等相結(jié)合組裝于腫瘤細(xì)胞表面，與血小板表面整合素αIIbβ3結(jié)合促進(jìn)血小板向腫瘤細(xì)胞黏附聚集，促進(jìn)CTC clusters的形成[10]。

1.2.3Plakoglobin介導(dǎo)血小板黏附聚集促進(jìn)CTC clusters形成 Plakoglobin(PG)也叫盤狀珠蛋白，與β-catenin同源，是黏著連接和細(xì)胞橋粒組成成分，介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附作用。研究表明，敲除CTC clusters 中的PG或下調(diào)其表達(dá)可顯著減少CTC clusters 的形成和轉(zhuǎn)移，且以PG為腫瘤轉(zhuǎn)移靶標(biāo)的抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療策略在實(shí)際抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物篩選中已經(jīng)有所應(yīng)用[11]。另一方面，PG參與并調(diào)節(jié)血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(CD31)的形成。敲低PG的表達(dá)，能夠顯著抑制CD31的活性，并使得E-cadherin的膜分布不穩(wěn)定、integrin-β3活性下降，最終導(dǎo)致細(xì)胞黏附性降低、血小板聚集減少。PG還可以維持FN mRNA的穩(wěn)定性，增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性FN的表達(dá)，而PG的缺失可顯著降低FN的表達(dá)、CTC Clusters的形成和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[12]。

2 CTCs聚簇增強(qiáng)血行轉(zhuǎn)移能力的分子機(jī)制

腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)際上是個(gè)低效過程，相比大量進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，能夠在遠(yuǎn)端成功定植的少之又少。究其原因是CTCs失去原位腫瘤基質(zhì)的依托，在血行轉(zhuǎn)移中面臨巨大的生存壓力，主要包括氧化應(yīng)激、血流剪切力和免疫追殺等[13]，探究循環(huán)腫瘤細(xì)胞簇血行轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)的原因，對(duì)于臨床針對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移治療具有指導(dǎo)性作用。

2.1 細(xì)胞間黏附蛋白細(xì)胞間的黏附蛋白是CTCs在血液循環(huán)中以單個(gè)還是成簇類型存在的決定因素。相關(guān)報(bào)道顯示，黏附蛋白的高表達(dá)使得腫瘤細(xì)胞聚集成簇，增加其轉(zhuǎn)移潛力，大大縮短患者的生存期。例如，Plakoglobin在細(xì)胞間黏附結(jié)構(gòu)中起到將E-鈣黏素和α-連環(huán)蛋白連接的作用，維持了循環(huán)腫瘤細(xì)胞簇狀結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和細(xì)胞極性。除此之外，Plakoglobin還參與多種致癌信號(hào)通路，Kolligs等通過在大鼠RK3E上皮細(xì)胞中過表達(dá)Plakoglobin，促進(jìn)了腫瘤轉(zhuǎn)移，潛在的分子機(jī)制是該蛋白的過表達(dá)導(dǎo)致c-Myc的上調(diào)和TCF/Lef信號(hào)的激活；Chen等[14]研究表明，敲除橋粒芯蛋白3(DSG3)會(huì)破環(huán)其與Plakoglobin的結(jié)合，并導(dǎo)致c-myc、cyclin D1和MMP-7下游靶基因的表達(dá)下調(diào)，從而抑制細(xì)胞遷移和侵襲。Fibronectin的合成受血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1蛋白(TGF-β1)的調(diào)節(jié)，PDGF能夠誘導(dǎo)TGF-β1的分泌，從而促進(jìn)FN的合成與沉積，在CTC Clusters中，血小板的黏附聚集促使其分泌PDGF和TGFβ-1，使得FN合成增多，進(jìn)一步加強(qiáng)了CTC Clusters的穩(wěn)定性，增加了其在血行轉(zhuǎn)移中的生存能力[12]。Takagi等[15]培育出了Podoplanin的人單克隆抗體——MS-1，并且發(fā)現(xiàn)它能夠抑制PDPN-CLEC-2結(jié)合、PDPN誘導(dǎo)的血小板聚集以及PDPN介導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移。

總的來說，參與CTCclusters形成的蛋白涉及多條通路，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，因此可能作為潛在的預(yù)后生物標(biāo)志，成為治療腫瘤轉(zhuǎn)移的靶標(biāo)。

2.2 腫瘤細(xì)胞的EMT過程上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一種對(duì)胚胎形成、傷口愈合和腫瘤惡性進(jìn)展至關(guān)重要的細(xì)胞程序，EMT導(dǎo)致細(xì)胞之間以及細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用被重塑，使得腫瘤細(xì)胞由遷移能力弱的上皮狀態(tài)向侵襲能力強(qiáng)的間質(zhì)狀態(tài)轉(zhuǎn)化。同時(shí)，EMT增加了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能，是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的重要原因[16]。

EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子可以將非轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞轉(zhuǎn)變成能夠侵襲和轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，有研究表明，胰腺癌小鼠模型中ZEB1和SNAIL的表達(dá)是癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移所必須的[17]，SLUG的表達(dá)可以使得原本非轉(zhuǎn)移細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力[18]，證實(shí)了EMT過程對(duì)于腫瘤轉(zhuǎn)移的重要性。而在成簇脫落的循環(huán)腫瘤細(xì)胞中經(jīng)歷的是部分EMT，經(jīng)過轉(zhuǎn)化后，外部以間質(zhì)狀態(tài)存在，而內(nèi)部仍保持上皮連接狀態(tài)，外周的間質(zhì)細(xì)胞為內(nèi)部上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)移鋪平了道路[19]。多項(xiàng)研究表明，上皮連接成分的持續(xù)表達(dá)對(duì)于CTC clusters本身的穩(wěn)定性是必需的，而間質(zhì)細(xì)胞則進(jìn)一步增強(qiáng)了轉(zhuǎn)移潛能[20]。此外，來自同一腫瘤患者的CTC clusters中上皮/間質(zhì)表達(dá)并不是恒定的，而是隨著耐藥性的產(chǎn)生，間質(zhì)細(xì)胞的比例也隨之上升，當(dāng)引入新的有效治療方案，間質(zhì)細(xì)胞比例又急劇下降[21]。上述研究表明，CTC clusters中EMT特征不僅反映了其固有的侵襲性，還能反映治療方案的耐藥情況，但關(guān)于EMT在循環(huán)腫瘤細(xì)胞簇的轉(zhuǎn)移過程的具體狀態(tài)尚未得到完全闡明，探究影響上皮/間充質(zhì)狀態(tài)的信號(hào)通路是開發(fā)靶向治療處于不同狀態(tài)腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵步驟。

2.3 DNA甲基化DNA甲基化異常，包括全基因組低甲基化和高甲基化，與多種人類癌癥相關(guān)，兩種表觀遺傳修飾均具有改變鄰近基因表達(dá)并促進(jìn)癌癥發(fā)展的能力[22]。Gkountela等[1]通過分析來自乳腺癌患者和NSG小鼠異種移植模型(patient-derived tumor xenograft，PDX)中CTCs的DNA甲基化圖譜，發(fā)現(xiàn)了諸多甲基化差異區(qū)域(differentially methylated regions，DMRs)，單個(gè)CTC中低甲基化轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(Transcription factor binding sites，TFBS)包括JUN，MIXL1、SHOX2、MEF2C等，這些基因常在各種腫瘤中富集；而CTC聚簇導(dǎo)致主導(dǎo)干性和調(diào)節(jié)增殖相關(guān)基因的TFBS特異性低甲基化，例如OCT4、MANOG、SOX2和SIN3A，并伴隨有多梳抑制復(fù)合物2(polycomb-repressive complex 2，PRC2)目標(biāo)基因啟動(dòng)子和基因體(包括SUZ12和EED的靶標(biāo))超甲基化及H3K27me3抑制，這些改變共同增加了CTC clusters的血行轉(zhuǎn)移能力。循環(huán)中CTCs表型的差異決定了DNA甲基化狀態(tài)，因此監(jiān)測(cè)異常的DNA甲基化可能是一種富有前景的提前發(fā)現(xiàn)腫瘤惡化的手段，可用于腫瘤的早期檢測(cè)、去甲基化治療和預(yù)后評(píng)估。

2.4 異質(zhì)性來自同一個(gè)體血液循環(huán)中的CTC clusters并非簡(jiǎn)單的由腫瘤細(xì)胞聚集而成，而是由腫瘤細(xì)胞、血小板、成纖維細(xì)胞和相關(guān)黏附蛋白等共同組成的，這些非腫瘤細(xì)胞成分有利于CTCs的生存和轉(zhuǎn)移。血小板通過旁分泌信號(hào)傳導(dǎo)和直接接觸來物理屏蔽其他復(fù)雜的影響，從而保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受血液剪切損傷和免疫攻擊[23]。血小板還可以通過分泌TGF-β并與腫瘤細(xì)胞直接相互作用，通過TGF-β/Smad和NF-κB途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行EMT。成纖維細(xì)胞的存在增加了CTC clusters內(nèi)腫瘤細(xì)胞的活力，并促進(jìn)了轉(zhuǎn)移的形成，而當(dāng)癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞部分耗盡時(shí)，可以觀察到轉(zhuǎn)移的數(shù)量明顯減少[24]?？偠灾珻TC clusters復(fù)雜的組成具有明顯的異質(zhì)性，未來的研究應(yīng)著重于CTC clusters組成的動(dòng)態(tài)變化，關(guān)注個(gè)各成分之間的相互作用及對(duì)轉(zhuǎn)移的影響。

3 CTC clusters在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用

腫瘤轉(zhuǎn)移是個(gè)復(fù)雜的、多步驟的過程，現(xiàn)代研究將腫瘤轉(zhuǎn)移過程大致分為以下環(huán)節(jié)，即：腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)部位、腫瘤血管生長(zhǎng)、腫瘤細(xì)胞滲透進(jìn)入血管、腫瘤細(xì)胞在血液循環(huán)中運(yùn)行、腫瘤細(xì)胞溢出血管、腫瘤細(xì)胞在目的器官植入并生長(zhǎng)。在整個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，CTC clusters在其中扮演了一個(gè)轉(zhuǎn)移前體“種子”的角色，通過血行轉(zhuǎn)移到達(dá)合適的“土壤”器官進(jìn)行定植，最終形成轉(zhuǎn)移病灶。CTC clusters的分子特征體現(xiàn)了其生存優(yōu)勢(shì)和轉(zhuǎn)移潛力，同時(shí)為腫瘤治療過程中產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制提供了新的線索。當(dāng)前對(duì)CTC clusters的研究集中在影響CTC clusters內(nèi)腫瘤細(xì)胞聚集的分子，這些分子可能成為治療的良好靶標(biāo)。在乳腺癌的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，盤狀珠蛋白和角蛋白-14與橋粒和半橋粒密切相關(guān)，對(duì)CTC clusters的形成至關(guān)重要[11,25]，抑制這些蛋白的表達(dá)可減少CTC clusters的形成和腫瘤的轉(zhuǎn)移。此外，一些促炎細(xì)胞因子，例如白介素-6和腫瘤壞死因子-α也可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞成簇生長(zhǎng)，并在循環(huán)系統(tǒng)中誘導(dǎo)黏附募集[26]。

現(xiàn)有的研究部分闡明了CTC clusters具有更高轉(zhuǎn)移潛能的原因，主要涉及黏附聚集、甲基化、EMT、異質(zhì)性等。此外，還有報(bào)道表明，CTCclusters通過循環(huán)的galectin-3和癌癥相關(guān)的粘蛋白1(MUC1)之間的相互作用減少凋亡，同時(shí)促進(jìn)了CTC clusters在循環(huán)系統(tǒng)中的形成和存活[27]。通過與腫瘤細(xì)胞表面的MUC1相互作用，循環(huán)中升高的galectin-3也促進(jìn)了腫瘤與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步加深了我們對(duì)CTC clusters轉(zhuǎn)移機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并提供了一種預(yù)防轉(zhuǎn)移的新穎治療方法。

4 CTC clusters的臨床治療價(jià)值

CTC clusters在腫瘤患者的早期檢查、治療效果評(píng)估和腫瘤復(fù)發(fā)檢測(cè)等方面具有巨大的潛力，且已經(jīng)參與了許多臨床前研究和臨床試驗(yàn)。研究人員對(duì)CTC clusters臨床意義的探究，發(fā)現(xiàn)患者循環(huán)中存在的CTCs與不良生存結(jié)局密切相關(guān)。

針對(duì)細(xì)胞簇的治療手段也逐年興起。Aceto等[2]通過篩選2 486種FDA批準(zhǔn)的化合物，發(fā)現(xiàn)Na+/K+-ATP酶抑制劑通過增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，可以抑制腫瘤細(xì)胞間緊密連接和橋粒的形成，達(dá)到解離CTCclusters的效果，并在小鼠模型上證實(shí)了其對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。

人類和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的大多數(shù)實(shí)體瘤都包含大量的纖維蛋白，提示纖維蛋白和纖維蛋白原在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，低分子量的肝素可直接導(dǎo)致血纖維蛋白溶解，肝素治療的患者具有明顯的生存收益，但研究尚未證實(shí)肝素和其他抗血栓形成藥物的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用是否對(duì)臨床有益。目前，溶栓劑(如尿激酶)破壞細(xì)胞聚集的能力已得到充分證明，該特性有時(shí)可用于癌癥患者血管內(nèi)凝血，Choi JW等將尿激酶靜脈注射到肺癌模型小鼠，成功提高了小鼠的存活率，顯示了針對(duì)CTC clusters的治療潛力，解離循環(huán)中的CTC clusters可以很大程度減少癌癥的轉(zhuǎn)移[28]。因此，除了靶向黏附蛋白外，直接作用血纖蛋白原可能是控制CTC clusters的另一種有前景的方法。

治療期間CTC clusters的基因表達(dá)和變化也引起了研究人員的注意，在前列腺癌患者中，抗氧化劑基因的表達(dá)水平具有良好的預(yù)后和預(yù)測(cè)價(jià)值，可用于評(píng)估治療和監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)。血行轉(zhuǎn)移中，Zhang等[29]發(fā)現(xiàn)編碼COX-2的PTGS2基因上調(diào)程度較高,COX-2是誘導(dǎo)型酶，在乳腺癌，結(jié)直腸癌，肺癌和胰腺癌和黑素瘤中經(jīng)常過表達(dá)，并且與不良預(yù)后相關(guān)，可將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素，提高癌細(xì)胞存活率，增加生長(zhǎng)、遷移、侵襲能力和干細(xì)胞樣特性，并且與血管生成和免疫抑制相關(guān)，揭示了COX-2抑制劑在抗轉(zhuǎn)移中的潛在應(yīng)用。

CTC clusters的臨床價(jià)值毋庸置疑，通過解離CTC clusters或許可以減少腫瘤的轉(zhuǎn)移，但解離后形成的單個(gè)CTC對(duì)轉(zhuǎn)移的影響仍然也需要注意，因此，關(guān)于CTC clusters合理的臨床應(yīng)用策略還需要進(jìn)一步研究。

5 總結(jié)與展望

在腫瘤細(xì)胞的血行轉(zhuǎn)移過程中，與單個(gè)CTC相比，CTC clusters賦予了腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的生存能力。通常脫離基質(zhì)的腫瘤細(xì)胞首先面臨失巢凋亡的威脅，而乳腺癌PDX模型中CTC clusters的RNAseq分析結(jié)果顯示凋亡相關(guān)的信號(hào)通路整體下調(diào)，這與檢測(cè)到抗凋亡蛋白Bcl-2過表達(dá)的結(jié)果相一致，共同增加了CTC clusters的抗凋亡能力。進(jìn)入循環(huán)中CTC clusters主要面臨血流剪切力以及免疫系統(tǒng)的殺傷，目前普遍認(rèn)為CTC clusters中發(fā)生的部分EMT使其產(chǎn)生的可變形性是抵抗血流剪切力的主要原因，而免疫逃逸涉及多種機(jī)制，例如免疫檢查點(diǎn)在CTC clusters中過表達(dá)、II型干擾素和TNF信號(hào)傳導(dǎo)途徑下調(diào)、T細(xì)胞激活基因的下調(diào)等[13]。總的來說，CTCclusters對(duì)腫瘤血行轉(zhuǎn)移更為重要，能夠完整的顯示CTCs攜帶的遺傳信息，更適合作為液體活檢的生物標(biāo)志物來評(píng)價(jià)治療效果、檢測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)以及用于預(yù)后評(píng)估。

但在CTC clusters的研究中仍有幾個(gè)問題亟待解決，首先是CTC clusters的分離檢測(cè)難題，目前的分離系統(tǒng)主要是針對(duì)單個(gè)CTC的分離篩選，而CTC clusters因其在循環(huán)中的稀有性導(dǎo)致了捕獲難度大幅增加，形態(tài)上個(gè)體差異大，難以匹配合適的孔徑，且容易造成濾孔堵塞，使得捕獲后不易完整釋放，進(jìn)而影響下游分析，因此首要目標(biāo)是確定一套合適的分選技術(shù)和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[30]。其次，CTC clusters的形成機(jī)制尚未完全解釋清楚，目前報(bào)道的PDPN、FN和PG等黏附蛋白在介導(dǎo)血小板結(jié)合腫瘤細(xì)胞形成CTC clusters中發(fā)揮了重要作用，通過探究CTC clusters的形成機(jī)制，可以更好的指導(dǎo)臨床合理用藥進(jìn)行針對(duì)治療。最后，CTC clusters內(nèi)部的異質(zhì)性始終是個(gè)復(fù)雜問題，關(guān)注CTC clusters組成的動(dòng)態(tài)變化，探究各個(gè)成分之間的相互作用及對(duì)轉(zhuǎn)移能力的影響也是未來研究的主要方向。