戴斌 黃翠萍 曹喆 吳甘霖 熊麗 胡一明 虞凱 謝青

(1湖北科技學(xué)院臨床學(xué)院內(nèi)科，湖北 咸寧 437100；咸寧市中心醫(yī)院 2呼吸內(nèi)科；3腫瘤科)

肺癌為我國發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤，我國2000～2014年登記地區(qū)的肺癌發(fā)病率呈緩慢上升趨勢，男性患者發(fā)病年齡略有降低，農(nóng)村地區(qū)患者有所上升〔1〕。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)包括鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌，NSCLC約為肺癌的80%，患者確診為NSCLC時多處于中晚期，且患者年齡較高對化療耐受性差，導(dǎo)致患者預(yù)后較差。近年來，程序性死亡分子(PD)-1與細(xì)胞程序性死亡-配體(PD-L)1結(jié)合所導(dǎo)致的免疫逃避作用已成為腫瘤治療的有效靶點，為治療晚期NSCLC帶來了新的方向〔2〕。以納武利尤單抗注射液為代表的PD-1抑制劑已在國內(nèi)上市，然而在臨床治療過程中，PD-1抑制劑單獨(dú)使用的響應(yīng)率僅在20%～40%〔3〕，大部分患者未曾獲益，PD-1抑制劑治療前后患者T淋巴細(xì)胞亞群、自然殺傷(NK)細(xì)胞及抑制性免疫檢查點如何變化值得進(jìn)一步研究。本研究擬觀察晚期NSCLC 患者應(yīng)用PD-1治療前后T淋巴細(xì)胞亞群、NK細(xì)胞及抑制性免疫檢查點B和T淋巴細(xì)胞弱化因子(BTLA)、淋巴細(xì)胞活化因子(LAG3)、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白(TIM3)的表達(dá)水平，推斷其變化與臨床療效之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究經(jīng)湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院(咸寧市中心醫(yī)院)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，選擇咸寧市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科、腫瘤科2018年10月至2019年12月收治的晚期NSCLC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者化療方案為鉑類，或接受表皮生長因子受體抑制劑，或接受間變性淋巴瘤激酶抑制劑，經(jīng)上述方案治療后影像學(xué)診斷為進(jìn)展；②根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)第8版TNM分期為ⅢB期和Ⅳ期的患者；③患者Karnofsky功能狀態(tài)評分≥60分，預(yù)期壽命超過6個月；④同意參與本項研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者心肺功能不全；②合并嚴(yán)重心腦血管疾??；③合并嚴(yán)重肝腎功能不全；④患者未完成2個周期化療。最終納入研究NSCLC患者28例，平均年齡(59.1±12.2)歲；其中男17例、女11例；鱗癌 9例 、腺癌13例、 大細(xì)胞癌6例；ⅢB期13例、Ⅳ期15例。經(jīng)過6個周期治療后，9例患者被評估為PD分為治療無效組，SD 13例、PR 3例分為治療有效組。有2例患者因病情進(jìn)展導(dǎo)致死亡，1例患者未能耐受免疫治療，未納入統(tǒng)計結(jié)果。

1.2方法 給予患者納武利尤單抗注射液(100 mg/10 ml，百時美施貴寶，美國)，劑量為3 mg/kg，靜脈滴注，滴注持續(xù)時間60 min，患者每2 w 1次，共進(jìn)行6個周期的治療。

1.3流式細(xì)胞儀檢測 抽取患者治療前1 d，治療6個周期后，清晨空腹靜脈血5 ml，每名患者采集2次，吸取100 μl靜脈血加入流式管，并編號，吸取異硫氰酸熒光素(FITC)-CD3、FITC-CD4、藻紅蛋白(PE)-CD8、PE-CD56、PE-LAG3、PE-BTLA、PE-TIM3單克隆抗體(BD公司，美國)10 μl至流式管中，震蕩混勻，4℃避光孵育20 min后，加入紅細(xì)胞裂解液500 μl，震蕩混勻后，避光孵育15 min，隨后加入預(yù)冷PBS 500 μl，震蕩混勻后，4℃避光靜置終止裂解，4℃離心(1 200 r/min，5 min)后，吸棄上清，隨后加入預(yù)冷PBS 400 μl，采用流式細(xì)胞儀(FACSVerse，BD公司，美國)檢測，F(xiàn)lowjo軟件處理流式結(jié)果。

1.4療效及不良反應(yīng)評價 采用實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)(RECIST)1.1對患者療效進(jìn)行評價〔4〕，患者至少具有一個可供測量病灶，通過CT、磁共振成像(MRI)等影像學(xué)手段，對患者腫瘤病灶的最大直徑進(jìn)行測量。評價標(biāo)準(zhǔn)如下，完全緩解(CR)：所有腫瘤病灶消失；部分緩解(PR)：基線腫瘤病灶最大直徑總和縮小>30%；病情穩(wěn)定(SD)：基線腫瘤病灶最大直徑總和有所縮小但未達(dá)PR或者增加未達(dá)病情進(jìn)展(PD)；PD：基線腫瘤病灶最大直徑總和增加>20%或者發(fā)現(xiàn)新的腫瘤病灶。兩組不良反應(yīng)評價按照抗癌藥物毒副反應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級評價〔5〕。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兩組治療前后T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞的比較 與治療前相比，治療后有效組CD4+、CD4+/CD8+明顯升高、CD8+明顯降低，與無效組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，CD8+、NK細(xì)胞治療前后兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。

2.2兩組治療前后抑制性免疫檢查點比較 治療前有效組BTLA在CD8+的表達(dá)明顯低于無效組、LAG3在CD4+、CD8+、NK細(xì)胞表達(dá)明顯高于無效組，治療后有效組BTLA在CD4+、CD8+的表達(dá)明顯高于無效組，LAG3在CD4+、CD8+、NK細(xì)胞表達(dá)明顯低于無效組，TIM3在CD8+、NK細(xì)胞表達(dá)明顯高于無效組(均P<0.05)，見表2。

2.3不良反應(yīng) 有效組不良反應(yīng)發(fā)生率為68.75%，其中皮疹3例，發(fā)熱2例，疲乏2例，消化道癥狀3例為Ⅰ～Ⅱ級反應(yīng)，1例甲狀腺功能減退為Ⅲ級反應(yīng)，無效組不良反應(yīng)發(fā)生率為66.67%，其中皮疹1例，發(fā)熱2例，疲乏1例，消化道癥狀1例為Ⅰ～Ⅱ級反應(yīng)，1例骨髓抑制為Ⅲ～Ⅳ級反應(yīng)，兩組不良反應(yīng)發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 兩組治療前后T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞的比較

表2 兩組治療前后抑制性免疫檢查點比較

3 討 論

PD-1是一種重要的免疫抑制分子，活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、不同腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞等均有PD-1表達(dá)。NSCLC發(fā)展進(jìn)程中，腫瘤細(xì)胞通過表達(dá)PD-1、PD-L1，招募大量免疫抑制細(xì)胞及細(xì)胞因子，促使腫瘤微環(huán)境向免疫抑制轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤發(fā)生及進(jìn)展〔6〕。NSCLC進(jìn)展迅速，多數(shù)患者確診時為晚期，NSCLC患者目前的生存現(xiàn)狀及預(yù)后均不容樂觀，以納武利尤單抗注射液為代表的PD-1抑制劑為治療NSCLC提供了新的手段〔7〕。

在NSCLC發(fā)展進(jìn)程中，腫瘤特異性T細(xì)胞的凋亡受PD-1依賴和非依賴機(jī)制介導(dǎo)，PD-1依賴機(jī)制能夠促進(jìn)NSCLC患者中的腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。研究發(fā)現(xiàn)外周血淋巴細(xì)胞免疫亞群比例在NSCLC患者中可出現(xiàn)異常，NSCLC患者外周血CD8+細(xì)胞增多，CD4+細(xì)胞下降，CD4+/CD8+降低，腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，而腫瘤負(fù)荷解除時，出現(xiàn)異常的淋巴細(xì)胞亞群可逐漸恢復(fù)〔8〕，此外PD-1抑制劑在臨床應(yīng)用過程中，NSCLC患者對其響應(yīng)率并不高。因此有必要選擇T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞的變化，作為監(jiān)測PD-1抑制劑治療NSCLC患者的療效及預(yù)后指標(biāo)。本研究提示對PD-1抑制劑響應(yīng)率較高的NSCLC患者，治療后T淋巴細(xì)胞的功能夠恢復(fù)。

腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸時，抑制性免疫檢查點的變化為其不可缺少的一部分，PD-1抑制劑治療NSCLC過程中，抑制性免疫檢查點的表達(dá)水平既反映了腫瘤的免疫情況也反映了免疫治療對患者免疫功能的影響〔9〕。BTLA激活后能夠抑制T淋巴細(xì)胞亞群中CD3+的表達(dá)，在T淋巴細(xì)胞早期活化階段BTLA發(fā)揮著負(fù)性調(diào)節(jié)，同時BTLA在腫瘤患者抗腫瘤免疫應(yīng)答中具有重要作用〔10〕。本研究提示NSCLC患者對PD-1抑制劑的響應(yīng)可能與BTLA在CD4+、CD8+表達(dá)動態(tài)變化相關(guān)。LAG3能夠負(fù)向調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞亞群中CD4+、CD8+的表達(dá)，LAG3和PD-1在腫瘤組織中共表達(dá)，同時阻斷LAG3和PD-1可恢復(fù)T淋巴細(xì)胞抗腫瘤作用〔11〕。本研究提示NSCLC患者對PD-1抑制劑的響應(yīng)可能與LAG-3的表達(dá)持續(xù)動態(tài)變化相關(guān)。TIM3具有誘導(dǎo)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞增殖、增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞亞群CD8+毒性的作用，此外受腫瘤浸潤的樹突狀細(xì)胞表達(dá)的TIM3，能夠阻斷樹突狀細(xì)胞與死亡腫瘤細(xì)胞釋放的DNA結(jié)合，固有免疫細(xì)胞的抗原遞呈受其影響降低，抑制固有免疫〔12〕，TIM3及PD-1同時阻斷時，T淋巴細(xì)胞耗竭受逆轉(zhuǎn)并且其抗腫瘤免疫功能恢復(fù)〔13〕。本研究提示NSCLC患者在接受PD-1抑制劑治療時，患者TIM3在CD8+、NK細(xì)胞的表達(dá)可能與治療效果相關(guān)。

研究表明，納武利尤單抗治療過程中常見不良反應(yīng)為疲乏、皮疹、發(fā)熱，甲狀腺功能減退〔14〕。本研究提示PD-1抑制劑在NSCLC患者使用中耐受性較好。

綜上，晚期NSCLC患者接受PD-1抑制劑治療時，不良反應(yīng)可耐受，T淋巴細(xì)胞亞群及抑制性免疫檢查點可出現(xiàn)變化，而無效患者T淋巴細(xì)胞亞群及抑制性免疫檢查點變化并不明顯，可能與患者自身基礎(chǔ)免疫低下相關(guān)。本研究提示，抑制性免疫檢查點可作為監(jiān)測NSCLC患者接受PD-1抑制劑治療時免疫狀態(tài)的監(jiān)測指標(biāo)。然而PD-1抑制劑國內(nèi)上市時間較短，治療費(fèi)用高昂，目前臨床應(yīng)用較少，需要進(jìn)一步的擴(kuò)大樣本，動態(tài)監(jiān)測NSCLC患者治療過程中T淋巴細(xì)胞亞群及抑制性免疫檢查點的變化。