王繼紅, 于光遠(yuǎn), 姜 穎

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 大連 116081)

凝血酶敏感蛋白-1(Thrombin-sensitive protein, Thrombospodin-1, TSP-1)是由人體內(nèi)多種細(xì)胞分泌的一種多結(jié)構(gòu)域、多功能的細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白,具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與黏附的功能,其功能與血管新生、炎癥、傷口愈合及癌癥等許多生理病理活動相關(guān)[1].

在TSP-1參與的多種生理病理活動中,其表現(xiàn)出的對血管新生的調(diào)節(jié)功能引起人們的關(guān)注.血管新生是從預(yù)先存在的血管系統(tǒng)中生出新血管的過程,這是胚胎發(fā)育、傷口愈合、癌癥等生理、病理條件所必需的.腫瘤生長尤其依賴血管新生過程,以此達(dá)到輸送氧氣和營養(yǎng)、帶走毒素和代謝物的目的.了解TSP-1對血管新生的調(diào)控功能及作用機制,有助于對TSP-1作用于血管新生靶點和通路的認(rèn)識,并為以TSP-1為基礎(chǔ)的內(nèi)源性血管新生抑制劑的研究提供參考.因此,本文將對TSP-1的結(jié)構(gòu)、血管新生調(diào)控功能及作用機制進(jìn)行綜述.

1 TSP-1的結(jié)構(gòu)特征

如圖1所示,TSP-1是一個分子量為450 kDa的同源三聚體,每一個TSP-1亞基都包含一個氨基末端和一個羧基末端球狀結(jié)構(gòu)域(G domain, G結(jié)構(gòu)域),兩者中間由一個細(xì)連接鏈連接.N端包含有一個肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Heparin-binding domain, HBD),也被稱為N結(jié)構(gòu)域.緊接N結(jié)構(gòu)域的是與三聚體組裝相關(guān)的前膠原蛋白同源區(qū)(Procollagen homology domain, P結(jié)構(gòu)域).P結(jié)構(gòu)域后是TSP-1所含有的3種重復(fù)序列,分別為typeⅠ序列(Thrombospondin typeⅠrepeats, TSR1s)、typeⅡ序列(TSR2s)、typeⅢ序列(TSR3s).TSR1s由圍繞著6個半胱氨酸殘基的模體重復(fù)3次組成,其不同的活化序列在腫瘤進(jìn)程中起著不同的作用；TSR2s也含有3個由6個半胱氨酸殘基圍繞的模體,它由60個氨基酸組成,具體功能尚未見報道；7個Ⅲ型重復(fù)序列TSR3s富含天冬氨酸殘基,具有Ca2+結(jié)合特性[2].

2 TSP-1結(jié)構(gòu)域受體及其功能

2.1 N結(jié)構(gòu)域受體及功能

N結(jié)構(gòu)域受體包括肝素(Heparin)、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)、多配體聚糖(Syndecan)、硫酸糖脂(Sulfated glycolipid)、多糖(Decorin)、纖維蛋白原(Fibrinogen)、整合素(α3β1、α4β1、α5β1、α9β1)[1-2].

關(guān)于其功能的研究表明,從TSP-1的N端水解下來的25 kDa的片段具有促進(jìn)血管生成的作用,同時還與內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲相關(guān)[3].

2.2 前膠原蛋白同源區(qū)P結(jié)構(gòu)域受體及功能

P結(jié)構(gòu)域受體包括CD36(GPIV)、Ⅰ～Ⅴ型膠原(Collagen typeⅠ～Ⅴ)、層連蛋白(Laminin)、纖連蛋白(Fibronectin)、纖溶酶原(Plasminogen)[1-2].

P結(jié)構(gòu)域可能具有抑制血管新生和內(nèi)皮細(xì)胞遷移的功能[4].

2.3 C端結(jié)構(gòu)域(G結(jié)構(gòu)域)受體及功能

G結(jié)構(gòu)域可以與多種細(xì)胞相互作用,也被稱為細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Cell-binding domain, CBD).該CBD中負(fù)責(zé)與細(xì)胞進(jìn)行相互作用的肽的序列已經(jīng)被鑒定出來,分別為IRVVM和RFYVVM[5].Sid等人的研究表明,TSP-1的C端結(jié)構(gòu)域可與整合素相關(guān)蛋白(Integrin-associated protein, IAP, CD47)結(jié)合,這是其能夠參與腫瘤細(xì)胞凋亡、黏附及侵襲等過程的原因之一[6].

2.4 TSR1s受體及功能

TSR1s由3個裂解素模體(Lysogenic motif 8)類重復(fù)序列組成,與來自瘧原蟲的環(huán)孢子蛋白(Circumsporozoite protein, CS蛋白)同源.該序列受體包括Latent TGFβ、CD36、HSPG、β1 integrin(α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、α6β1、α7β1、α8β1、α9β1、αVβ1)、Sulfated glycolipid、Ⅰ～Ⅳ型膠原(Collagen typeⅠ～Ⅳ)、Laminin、Fibronectin、纖維蛋白原(Fibrinogen)、刺激血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)、Plasminogen、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2, MMP-2)、Heparin、富含組氨酸糖蛋白(Histidine rich glycoprotein).

該序列參與誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,并抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及血管新生[7-8].

2.5 TSR2s受體及功能

TSR2s受體包括β1 integrin(α1β1、α2β1、α3β1、α4β1、α5β1、α6β1、α7β1、α8β1、α9β1、αVβ1)、Collagen typeⅠ～Ⅳ、Laminin、Fibronectin、Plasminogen.

TSR2s與表皮生長因子前體具有同源性[7-8].

2.6 TSR3s受體及功能

TSR3s受體包括整合素αⅤβ3、整合素αⅡβ3、組織蛋白酶G(Cathepsin G)、彈性蛋白酶(Elastase)、凝血酶(Thrombin)、二價陽離子.

TSR3s與小白蛋白(Parvalbumin)和鈣調(diào)蛋白(Calmodulin, CaM)的結(jié)構(gòu)同源,這些重組體構(gòu)成了TSP-1的多個鈣結(jié)合位點,且TSR3s中含有arg-gly-asp-ala(RGDA)氨基酸序列[7-8](圖1).

圖1 TSP-1的結(jié)構(gòu)及功能性結(jié)構(gòu)域(根據(jù)文獻(xiàn)[2]修改)Fig.1 Structural and functional domains of TSP-1 (modified from reference [2])

3 TSP-1涉及的信號通路

如上所述,TSP-1的多種功能取決于其結(jié)構(gòu)域可與多種細(xì)胞表面受體分子相互作用,其作用機制與TSP-1的受體涉及的通路有關(guān).除此之外,TSP-1還可以與多種參與血管新生的蛋白酶相互作用,包括纖溶酶原、尿激酶、基質(zhì)金屬蛋白酶、凝血酶、組織蛋白酶和彈性蛋白酶等[9].TSP-1的多數(shù)結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合多個受體,也表明受體系統(tǒng)之間可以相互作用、相互影響(圖2).

圖2 TSP-1抑制血管生成的信號通路(Protein Lounge數(shù)據(jù)庫)Fig.2 Inhibition of angiogenesis by TSP-1 (proteinlounge.com)

4 TSP-1與血管新生

血管新生對于惡性腫瘤的生長、遷移乃至預(yù)后的過程都有極其重要的影響.TSP-1可通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、黏附、遷移、侵襲等活動誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而抑制腫瘤的血管新生,進(jìn)而控制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[10-13]. 雖然有部分研究表明,TSP-l的裂解氨基末端表現(xiàn)出促血管新生的作用[14-15],且組織中的相關(guān)蛋白酶裂解產(chǎn)生的TSP-1片段也可能具有促進(jìn)血管新生的作用[16],但更多的研究認(rèn)為,TSP-1是內(nèi)源性血管新生抑制劑[17-18].

4.1 TSP-1與生長因子的關(guān)系

血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)是一種多功能細(xì)胞因子,可直接或間接促進(jìn)血管生成.在惡性腫瘤中,VEGF處于過度表達(dá)狀態(tài),可以促進(jìn)垂體內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移,TSP-1則能夠抑制VEGF的上述作用[19].秦云研究發(fā)現(xiàn),在原發(fā)性肝癌中,VEGF表達(dá)水平與TSP-1水平呈負(fù)相關(guān),VEGF表達(dá)水平越高,TSP-1水平越低[20],該現(xiàn)象在乳腺癌細(xì)胞中也有體現(xiàn)[19].另外,TSP-1與活性基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase, MMPs)的結(jié)合可以阻斷細(xì)胞外基質(zhì)中的VEGF與其受體的結(jié)合,進(jìn)而抑制血管生成[21].而Kaur等研究發(fā)現(xiàn),TSP-1可以與CD47結(jié)合,抑制VEGF與其受體VEGFR2結(jié)合,從而發(fā)揮抑制血管新生的作用[22].Lindner等人的研究結(jié)果表明,TSP-1通過其肝素結(jié)合域與堿性成纖維細(xì)胞生長因子-2(Basic fibroblast factor-2, bFGF-2)競爭性結(jié)合硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs),從而抑制血管生成[23].TSR1s還可結(jié)合并激活轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factor-β, TGF-β),從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移、血管新生和腫瘤生長[24-26].

4.2 TSP-1與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子的相互作用

TSP-1可以和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面多種黏附分子結(jié)合,包括CD36、整合素和CD47等在內(nèi)的12種以上細(xì)胞黏附分子受體[27-28].

CD148是一種跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶,在多種類型細(xì)胞中表達(dá)的TSP-1是其重要的功能配體.TSP-1中的TSR1s可與CD148分子相互作用,通過增強CD148的活性促進(jìn)酪氨酸的脫磷酸化,從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖.而在缺乏CD148時,TSP-1并未表現(xiàn)出抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用[29-30].TSP-1的氨基末端可通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞與基質(zhì)纖連蛋白的黏附,使內(nèi)皮細(xì)胞黏著斑喪失,從而間接抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖[31].

TSP-1與CD36之間的相互作用被認(rèn)為是抑制血管新生的重要機制[32-33].Volpert等人的研究表明,通過CD36-p59fyn-半胱天冬酶3(Caspase-3)-p38促分裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)級聯(lián)反應(yīng)、c-Jun氨基末端激酶和Fas/Fas配體的活化,CD36分子介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是TSP-1抑制血管新生作用的重要機制[34-36].

TSP-1還可通過與β1整合素相結(jié)合抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移[37],而TSP-1氨基末端的肝素結(jié)合位點能夠與鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin, CRT)等細(xì)胞表面蛋白相互作用,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附功能及運動功能,進(jìn)一步影響內(nèi)皮細(xì)胞的遷移[38].

4.3 來源于TSP的多肽片段抗血管新生及抗腫瘤研究進(jìn)展

由于TSP是一種具有多結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),其上述功能與結(jié)構(gòu)的相關(guān)性也引起了科學(xué)家們的關(guān)注.目前,對來源于TSP-1的多肽片段進(jìn)行的功能研究已取得一定的進(jìn)展.

Guo等人合成了TSP-1的Ⅰ型重復(fù)序列肽,研究結(jié)果表明,該合成肽及完整的TSP-1均能誘導(dǎo)牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡[39],證明其具有抑制牛內(nèi)皮細(xì)胞血管新生的功能.Iruela-Arispe等人采用含有第二個和第三個基因重組蛋白的片段(非前膠原區(qū)域)進(jìn)行了抗血管新生實驗.研究結(jié)果表明,Ⅰ型重復(fù)序列的氨基末端對bFGF-2誘導(dǎo)的血管新生具有更強效的抑制作用[40].Grundker等人基因重組表達(dá)了一個由人TSP-2的N末端區(qū)域和IgG-Fcl片段組成的融合蛋白(N-TSP2-Fc),并對其進(jìn)行了血管新生和抗腫瘤的相關(guān)研究.體內(nèi)實驗結(jié)果表明,每天腹腔注射N-TSP2-Fc,可顯著抑制免疫缺陷裸鼠乳腺中的人乳腺癌MDA-MB-435和MDA-MB-231細(xì)胞的生長及體內(nèi)腫瘤血管化,還能夠明顯抑制乳腺癌在淋巴結(jié)的區(qū)域轉(zhuǎn)移及肺的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移,這說明N-TSP2-Fc是一種有效的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子[41].Shen等人利用基因克隆手段,將PF4(58-70)與TSP-1(429-459)基因連接在一起,編碼了一個融合蛋白TSF.實驗結(jié)果表明,TSF可以呈劑量依賴性抑制牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞BAEC的增殖和遷移.GST-TSF、PF4(58-70)和TSP-1(429-459)也能抑制BAEC的增殖和遷移,但其抑制率沒有TSF高.CAM實驗結(jié)果顯示,TSF、GST-TSF、PF4(58-70)和TSP-1(429-459)都具有抗血管新生作用,但TSF的效果最優(yōu).體內(nèi)實驗結(jié)果表明,TSF可強效抑制Lewis肺癌,抑制率可達(dá)68.75% (劑量：1.00 μmol/kg).結(jié)果表明,該團(tuán)隊關(guān)于TSF基因的設(shè)計取得成功,TSF同時具有抗血管新生和抗腫瘤功能[42].

5 結(jié) 語

綜上所述,TSP-1是一種具有多結(jié)構(gòu)域和多受體的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,這使其具有多樣性的功能和復(fù)雜的作用靶點與信號通路.已有研究表明,來源于人的TSP-1片段具有抑制血管新生繼而抑制腫瘤的功能,這為開發(fā)以TSP-1為基礎(chǔ)的血管新生抑制劑提供了啟示.目前，本研究團(tuán)隊將目光聚焦在海洋生物TSP-1的功能研究上,因此關(guān)于人源TSP-1的結(jié)構(gòu)、功能及其抗血管新生作用機制的研究成果對于進(jìn)一步的研究具有非常重要的參考價值.研究不同物種來源的TSP-1結(jié)構(gòu)域片段的抗血管新生功能及作用機制,對于血管新生抑制劑新藥的探尋和創(chuàng)新性研發(fā)具有重要的科學(xué)意義.