陳軍芳，岳新榮，賀大春

胃癌（gastric cancer，GC）是一種常見的消化系統(tǒng)腫瘤，也是全球第4大最常見的惡行腫瘤[1]。近年來，盡管GC在手術(shù)治療、靶向治療和免疫治療方面取得了重大進(jìn)展，由于大多數(shù)GC患者首次診斷位于晚期，治療方案有限，預(yù)后仍然很差[2]。由于GC的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率較高，全球GC患者的5年生存率不足20%[3]。因此，迫切需要為GC的早期診斷和治療尋找新的靶點(diǎn)。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種長度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，近年來其在人類生理病理中的作用引起了越來越多的關(guān)注[4]。LncRNAs已被確定為癌癥發(fā)展過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，并參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、分化和凋亡等[5]。多種失調(diào)的lncRNAs，包括HOXC-AS3、ARAP1-AS1、TRPM2-AS和GCAT18均被證明與GC的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)[6-9]。同屬于lncRNAs家族的lncRNA MAFG-AS1（后續(xù)簡稱為MAFG-AS1）已經(jīng)被證實(shí)在多種癌癥組織中發(fā)揮促癌作用，如促進(jìn)肝癌和乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[10-11]。重要的是，MAFG-AS1在GC中表達(dá)上調(diào)，并與患者不良預(yù)后相關(guān)[12]。然而MAFG-AS1在GC中的生物學(xué)功能和作用機(jī)制尚待研究，因此在本研究中將探究MAFG-AS1在GC中生物學(xué)功能和可能的作用機(jī)制。

本研究首次發(fā)現(xiàn)MAFG-AS1在GC組織中上調(diào)，并與GC患者的預(yù)后不良相關(guān)?；诖耍M(jìn)一步探討MAFG-AS1在GC組織中通過調(diào)控微（microRNA，miRNA，miR）-143-3p/AKT2（AK mouse plus Transforming or Thymoma 2）軸在GC中發(fā)揮的生物學(xué)作用及其機(jī)制，以期為GC患者的臨床治療提供一條新的思路。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

收集經(jīng)本院醫(yī)院病理確診的39例GC患者的癌及其配對的癌旁正常組織（距原發(fā)灶邊緣3～5 cm以上的相應(yīng)癌旁組織）。所有組織均在手術(shù)切除后，立即放入－80 ℃低溫冰箱中保存，用于提取總RNA。所有患者均未接受放療、化療或靶向藥物治療。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 細(xì)胞、試劑及儀器

人胃黏膜正常上皮細(xì)胞GES-1和人GC細(xì)胞系BGC-823、SGC-7901和MGC-803細(xì)胞均購自美國模式菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。

RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司。定點(diǎn)突變試劑盒購自上海玉博生物科技有限公司。熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-basic、攜帶有MAFG-AS1的重組過表達(dá)質(zhì)粒及其對照空載體、miR-143-3p-模擬物（miR-143-3p-mimics）及其陰性對照-模擬物（NC-mimics）和特異性針對AKT2基因的siRNA（siAKT2）均購自美國Promega公司。TRIzol試劑和LipofectAMINETM2000試劑購自美國Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR預(yù)混劑EXTAQⅡ購自日本TaKaRa公司。CCK-8試劑盒、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒和電化學(xué)顯影試劑盒均購自中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Transwell小室購自美國Corning公司。兔抗人AKT2和GAPDH（內(nèi)參照）單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購自英國Abcam公司。ABI7500型熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.3 生物信息學(xué)分析

采用GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）（http://gepia.cancer-pku.cn/）分析MAFG-AS1在GC組織中的表達(dá)情況；使用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫（http://kmplot.com/analysis/index.php）分析MAFG-AS1的表達(dá)與GC預(yù)后的關(guān)系；采用StarBase數(shù)據(jù)庫（http://starbase.sysu.edu.cn）預(yù)測與MAFG-AS1結(jié)合的miRNA以及miR-143-3p下游的mRNA。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞和人GC細(xì)胞系BGC-823、SGC-7901和MGC-803均用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在細(xì)胞處于對數(shù)生長期時(shí)采用0.25%胰蛋白酶消化后傳代，以1×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板上，待細(xì)胞生長穩(wěn)定后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取處于對數(shù)生長期的MGC-803細(xì)胞，按照LipofectAMINETM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書提供的流程，將空載體（對照組）和MAFG-AS1過表達(dá)重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染MGC-803細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

組織處理：收集GC組織及相應(yīng)癌旁正常組織，稱取組織標(biāo)本約100 mg置于EP管中，加入1 mL TRIzol試劑裂解組織，使用勻漿器充分研磨組織，在低溫下提取組織中的總RNA。細(xì)胞處理：收集大約1×106個(gè)轉(zhuǎn)染后的MGC-803細(xì)胞，用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。

采用TRIzol試劑常規(guī)提取組織和細(xì)胞的總RNA后，檢測其純度后，取部分RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在ABI 7500系統(tǒng)上，采用SYBR預(yù)混劑EXTAQⅡ進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。以GADPH和U6作為內(nèi)參照。各實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)量相對于對照組的表達(dá)量變化倍數(shù)用2－ΔΔCt法計(jì)算，引物序列見表1。

1.7 CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖能力

將空載體（對照組）和MAFG-AS1過表達(dá)重組質(zhì)粒（MAFG-AS1組）MGC-803細(xì)胞接種于96孔板中，每孔1×103個(gè)細(xì)胞。分別于培養(yǎng)24、48、72和96 h加入10 μL的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，隨后在酶聯(lián)免疫酶標(biāo)儀波長450 nm處檢測各孔細(xì)胞的D值。

1.8 EdU染色法檢測細(xì)胞的增殖能力

實(shí)驗(yàn)分組同1.7節(jié)。取轉(zhuǎn)染后的MGC-803細(xì)胞分別接種于24孔板中，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)，每孔加入200 μL濃度為50 μmol/L的EdU染色液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，PBS清洗。隨后，采用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，室溫孵育10 min。加入200 μL濃度為2 mg/mL的甘氨酸孵育5 min后，搖床上PBS清洗5 min。每孔中加入100 μL含0.5%的TritonX-100的PBS溶液，搖床上脫色孵育10 min，PBS洗滌2次，每次5 min。加入Apollo室溫下避光染色30 min，再用DAPI染色液室溫避光孵育20 min。PBS清洗后在熒光顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)，分析結(jié)果。藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞總數(shù)，綠色熒光標(biāo)記增殖的細(xì)胞，細(xì)胞增殖率（%）＝綠色熒光細(xì)胞數(shù)/藍(lán)色熒光細(xì)胞數(shù)×100%。

1.9 Transwell小室實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分組同1.7節(jié)。取對數(shù)生長期的MGC-803細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，用含1%胎牛血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞且計(jì)數(shù)，單細(xì)胞懸液的密度為2×106個(gè)/mL，取200 μL細(xì)胞懸液接種于小室的上室中，小室的下室中則加入600 μL完全培養(yǎng)液。細(xì)胞接種24 h后，將小室直接浸泡于甲醇溶液中室溫固定 20 min。待細(xì)胞固定后，吸除小室上室中的培養(yǎng)液，用棉簽小心擦去剩余培養(yǎng)液和未穿過小室膜的細(xì)胞。將小室放入含1%結(jié)晶紫的染色液中，室溫染色10 min，流動(dòng)水沖洗小室，晾干水分，在光學(xué)顯微鏡下（放大倍數(shù)為200倍）觀察細(xì)胞形態(tài)并計(jì)數(shù)，拍照保存檢測結(jié)果。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 The primer sequence of real-time fluorescent quantitative PCR

1.10 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測

采用定點(diǎn)突變試劑盒對預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變。將MAFG-AS1和AKT2 mRNA 3’-非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）中含有預(yù)測miRNA結(jié)合位點(diǎn)的序列片段插入到熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-basic中，從而分別構(gòu)建野生型（wild type，WT）和突變型（mutant type，MUT）熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（MAFG-AS1-WT、MAFG-AS1-MUT、AKT2-WT和AKT2-MUT）。

將MGC-803細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)至融合度為70%時(shí)，收集細(xì)胞。采用轉(zhuǎn)染試劑LipofectAMINETM2000將MAFGAS1-WT、MAFG-AS1-MUT與miR-143-3p-mimics或NC-mimics兩兩組合共轉(zhuǎn)染MGC-803細(xì)胞，驗(yàn)證MAFG-AS1和miR-143-3p的相關(guān)性；將AKT2-WT、AKT2-MUT和miR-143-3p-mimics或NCmimics兩兩組合共轉(zhuǎn)染MGC-803細(xì)胞，驗(yàn)證miR-143-3p與AKT2的相關(guān)性。轉(zhuǎn)染48 h后，按照試劑盒操作說明檢測各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.11 蛋白質(zhì)印跡法檢測MAFG-AS1過表達(dá)后上調(diào)miR-143-3p表達(dá)或下調(diào)AKT2表達(dá)對MGC-803細(xì)胞中AKT2蛋白表達(dá)水平的影響

實(shí)驗(yàn)分為4組：空載體組（對照組）、MAFG-AS1組、MAFG-AS1＋miR-143-3p組（共轉(zhuǎn)染MAFG-AS1過表達(dá)重組質(zhì)粒和miR-143-3p-mimics）和MAFG-AS1＋siAKT2組（共轉(zhuǎn)染MAFG-AS1過表達(dá)重組質(zhì)粒＋siAKT2）。采用RIPA裂解MGC-803細(xì)胞，提取細(xì)胞中的總蛋白。而后采用BCA法檢測蛋白濃度。取適量蛋白行10% SDS-PAGE分離蛋白，電泳結(jié)束后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉處理1 h，然后加入一抗[兔抗人AKT2單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶500）]在4 ℃下孵育過夜；用TBST洗膜后，加入二抗[辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1∶1 000）]室溫孵育1 h。加入電化學(xué)發(fā)光液發(fā)光顯影，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行圖像采集，使用Image J分析蛋白質(zhì)條帶。

1.12 功能補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)分為4組同1.11節(jié)。采用CCK-8法、EdU實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測MAFGAS1、miR-143-3p和AKT2對細(xì)胞增殖和遷移的影響。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件和Graphpad Prism 8對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)采用四格表（或百分率）表示，由于N＜40，采用確切概率法進(jìn)行差異分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MAFG-AS1在GC細(xì)胞和組織中過表達(dá)且與GC患者預(yù)后不良相關(guān)

為了探究MAFG-AS1在GC細(xì)胞中的表達(dá)水平，首先通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，MAFG-AS1在GC組織中高表達(dá)（圖1A），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

隨后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測39例GC患者癌及癌旁組織中，以及人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞和人GC細(xì)胞系BGC-823、SGC-7901和MGC-803細(xì)胞中MAFG-AS1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，MAFGAS1在GC組織的表達(dá)水平明顯上調(diào)（P值均＜0.001）（圖1B）；與人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞相比，人GC細(xì)胞系BGC-823、SGC-7901和MGC-803細(xì)胞中的表達(dá)水平均明顯上調(diào)（P值均＜0.001）（圖1C）。MAFG-AS1高表達(dá)與GC患者是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＝0.010 4）和分化程度低（P＝0.0150）具有相關(guān)性（表2）。

Fig.1 Relationship between the expression of long non-coding RNA (lncRNA) MAFG-AS1 and prognosis of gastric cancer(GC) patients.A:MAFG-AS1 expression from Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA);B-C:MAFGAS1 expression in GC tissues and cells (BGC-823,SGC-7901 and MGC-803 cells,normal gastric epithelial GES-1 cells as the control) was detected by real-time fluorescent quantitative PCR;D:The expression level of MAFG-AS1 was negatively correlated with the overall survival,first progression survival and post-progression survival.T:Tumor tissue;N:Para-cancerous normal tissue;HR:Hazard ratio;**P＜0.01,***P＜0.001,vs GES-1 cells (n=3).圖1 LncRNA MAFG-AS1在GC組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平及與GC患者生存期的關(guān)系

通過Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，MAFG-AS1高表達(dá)與GC患者的總體生存期（overall survival，OS）和首次進(jìn)展生存期（first progression survival）以及后進(jìn)展生存期（postprogression survival）呈負(fù)相關(guān)（圖1D），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000 56，P＝2.6×10－6和P＝0.011）。由此可見，MAFG-AS1的表達(dá)失調(diào)與GC患者預(yù)后不良密切相關(guān)。

2.2 過表達(dá)MAFG-AS1顯著促進(jìn)GC細(xì)胞的增殖和遷移

為了驗(yàn)證MAFG-AS1在GC中的作用，將MAFG-AS1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入MGC-803細(xì)胞中，隨后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測MAFG-AS1表達(dá)水平。結(jié)果（圖2A）顯示，空載體組（對照組）和MAFG-AS1組中MAFG-AS1的表達(dá)量分別為1.0±0.14和3.1±0.33，相較于對照組，MAFG-AS1組中MAFG-AS1的表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.001）。

CCK-8法檢測結(jié)果（圖2B）顯示，與對照組相比，MAFG-AS1組的細(xì)胞活力明顯升高，從48 h時(shí)開始，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。

EdU實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果（圖2C）顯示，對照組和MAFG-AS1組細(xì)胞EdU染色陽性細(xì)胞所占百分比分別為（29.2±3.3）%和（69.5±7.3）%，MAFG-AS1組細(xì)胞的陽性率明顯高于對照組（P＜0.001）。

Transweell小室實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果（圖2D）顯示，對照組和MAFG-AS1組發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)分別為（62.4±6.5）個(gè)和（152.6±17.3）個(gè)，MAFG-AS1組發(fā)生細(xì)胞的遷移數(shù)明顯多于對照組（P＜0.01）。

2.3 miR-143-3p是MAFG-AS1的下游靶標(biāo)

通過StarBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測了MAFG-AS1與miR-143-3p存在結(jié)合位點(diǎn)（圖3A）。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測癌及癌旁組織中miR-143-3p的表達(dá)水平，結(jié)果（圖3B）顯示，與癌旁組織相比，miR-143-3p表達(dá)水平在GC組織中明顯下調(diào)（P＜0.001）。同時(shí)，Pearson相關(guān)性分析結(jié)果（圖3C）表明，MAFG-AS1與miR-143-3p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（R2＝0.144 8，P＜0.05）。

通過雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)進(jìn)一步探究MAFG-AS1與miR-143-3p的關(guān)系。結(jié)果（圖3D）顯示，上調(diào)miR-143-3p表達(dá)可明顯抑制MAFG-AS1-WT的熒光素酶活性（P＜0.001），而對MAFG-AS1-MUT的熒光素酶活性無明顯影響（P＞0.05）。隨后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測發(fā)現(xiàn)（圖3E），過表達(dá)MAFG-AS1可抑制miR-143-3p的表達(dá)水平（P＜0.01），而上調(diào)miR-143-3p表達(dá)水平對MAFG-AS1的表達(dá)無明顯影響（P＞0.05）。由此可見，GC中MAFG-AS1直接靶向miR-143-3p，并負(fù)調(diào)節(jié)其的表達(dá)。

表2 LncRNA MAFG-AS1表達(dá)與GC患者臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Correlation between clinicopathological features and expression of long non-coding RNA(lncRNA) MAFG-AS1 in 39 patients with gastric cancer (GC)N＝39,n

Fig.2 Effects of long non-coding RNA (lncRNA) MAFG-AS1 on proliferation and migration of gastric cancer (GC)MGC-803 cells.A:The transfection efficiency was detected by real-time fluorescent quantitative PCR;B-C:The efffect of MAFG-AS1 overexpression on the proliferation of MGC-803 cells was detected by CCK-8 assay and EdU staining,respectively;D:Transwell assay was conducted to evaluate the effect of MAFG-AS1 overexpression on MGC-803 cells migration.MAFG-AS1 group:MGC-803 cells were transfected with recombinant plasmid expressing MAFG-AS1 by liposome.MGC-803 cells were transfected with empty vector by liposome as the control;*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001,vs the control group (n=3).圖2 過表達(dá)MAFG-AS1對MGC-803細(xì)胞增殖和遷移的影響

2.4 LncRNA MAFG-AS1通過靶向結(jié)合miR-143-3p上調(diào)AKT2的表達(dá)

通過分析StarBase數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，AKT2與miR-143-3p存在結(jié)合位點(diǎn)（圖4A）。隨后，通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測發(fā)現(xiàn)（圖4B），轉(zhuǎn)染miR-143-3p-mimics可抑制AKT2-WT組的熒光素酶活性（P＜0.01），而對AKT2-MUT組的熒光素酶活性無明顯影響（P＞0.05）。

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果（圖4C）顯示，過表達(dá)MAFG-AS1可上調(diào)AKT2蛋白的表達(dá)水平，而上調(diào)miR-143-3p表達(dá)或敲低AKT2表達(dá)均可抑制AKT2蛋白的表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.001）。

Fig.3 Long non-coding RNA (lncRNA) MAFG-AS1 directly targets miR-143-3p.A:The binding site between MAFGAS1 and miR-143-3p was predicted through the StarBase database;B:The miR-143-3p expression level in gastric cancer(GC) and para-tumor tissues was detected by real-time fluorescent quantitative PCR;C:Pearson correlation analysis was conducted to evaluate the relevance between the expressions of MAFG-AS1 and miR-143-3p.D:Dual-luciferase reporter assay was conducted to detect the relationship between MAFG-AS1 and miR-143-3p;E:MAFG-AS1 and miR-143-3p expression levels in MGC-803 cells were detected by real-time fluorescent quantitative PCR.**P＜0.01,***P＜0.001 (n=3).圖3 分別采用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法驗(yàn)證MAFG-AS1和miR-143-3p的靶向關(guān)系

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測癌及其癌旁組織中MAFG-AS1、miR-143-3p和AKT2 mRNA的表達(dá)水平，再用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，miR-143-3p與AKT2 mRNA的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（R2＝0.364 0，P＜0.001）（圖4D），MAFG-AS1與AKT2 mRNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)（R2＝0.223 1，P＜0.05）（圖4E）。此外通過對StarBase數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)（圖4F），AKT2與MAFG-AS1的表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.229，P＝7.55×10－6）。由此推測，GC中MAFGAS1通過抑制miR-143-3p表達(dá)上調(diào)的AKT2的表達(dá)水平。

2.5 MAFG-AS1通過調(diào)控miR-143-3p/AKT2軸促進(jìn)MGC-803細(xì)胞的增殖和遷移

為了進(jìn)一步驗(yàn)證MAFG-AS1是否通過調(diào)控miR-143-3p/AKT2軸對MGC-803細(xì)胞的增殖和遷移產(chǎn)生影響，分別將空載體（對照組）、MAFG-AS1過表達(dá)重組質(zhì)粒（MAFG-AS1組）、MAFG-AS1過表達(dá)重組質(zhì)粒＋miR-143-3p-mimics（MAFG-AS1＋miR-143-3p組）和MAFG-AS1過表達(dá)重組質(zhì)粒＋siAKT2（MAFGAS1＋siAKT2組）分別轉(zhuǎn)入MGC-803細(xì)胞中。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測結(jié)果（圖5A）顯示，與對照組相比，MAFG-AS1過表達(dá)后miR-143-3p的表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.001）；相較與MAFG-AS1組，MAFG-AS1＋miR-143-3p組中miR-143-3p的表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.001），而MAFG-AS1＋siAKT2組中miR-143-3p的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化（P＞0.05）。

CCK-8法檢測結(jié)果（圖5B）顯示，與對照組相比，MAFG-AS1組細(xì)胞的活力明顯提高（P＜0.001），而MAFG-AS1＋miR-143-3p組和MAFG-AS1＋siAKT2組的細(xì)胞活力均低于MAFG-AS1組（P＜0.01和P＜0.001）。

EdU實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果（圖5C）顯示，對照組和MAFG-AS1組EdU染色陽性細(xì)胞所占的百分比分別為（31.5±3.5）%和（71.2±7.6）%，MAFG-AS1組細(xì)胞的增殖活性較對照明顯提高（P＜0.001）；MAFG-AS1＋miR-143-3p組和MAFG-AS1＋siAKT2組細(xì)胞的EdU染色陽性細(xì)胞所占的百分比分別為（37.5±3.9）%和（33.4±3.6）%，均低于MAFG-AS1組（P值均＜0.001）。

Transweell小室遷移實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果（圖5D）顯示，對照組和MAFG-AS1組發(fā)生細(xì)胞的遷移數(shù)分別為（57.6±6.3）個(gè)和（141.2±14.5）個(gè)，MAFG-AS1組發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組（P＜0.001）；MAFG-AS1＋miR-143-3p組和MAFG-AS1＋siAKT2組發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)分別為（64.3±6.7）個(gè)和（61.7±6.3）個(gè)，均低于MAFG-AS1組（P值均＜0.001）。

上述結(jié)果表明，MAFG-AS1可能通過抑制miR-143-3p表達(dá)促進(jìn)GC細(xì)胞的增殖和遷移。

Fig.5 The effects of long non-coding RNA (lncRNA) MAFG-AS1 on proliferation and migration of MGC-803 cells by regulating miR-143-3p/AKT2 axis.A:The transfection efficiency was detected by real-time fluorescent quantitative PCR;B-C:The effect of MAFG-AS1 on MGC-803 cells proliferation was detected by CCK-8 assay and EdU staining,respectively;D:Transwell assay was used to detect the effect of MAFG-AS1 on MGC-803 cells migration.**P＜0.01,***P＜0.001 (n=3).圖5 MAFG-AS1可能通過抑制miR-143-3p表達(dá)促進(jìn)MGC-803細(xì)胞的增殖和遷移

3 討論

LncRNA可分為基因內(nèi)lncRNA、基因間lncRNA、正義lncRNA及反義lncRNA等多種類型，在多個(gè)層面調(diào)控基因的表達(dá)，如調(diào)節(jié)其附近蛋白編碼基因的表達(dá)、參與調(diào)節(jié)其他RNA的加工、作為內(nèi)源競爭性RNA與miRNA結(jié)合進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)等[13]。近年來，越來越多的研究表明lncRNAs在包括GC在內(nèi)的多種腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[14-15]。有研究報(bào)道，MAFG-AS1通過抑制miR-147b的表達(dá)而上調(diào)NDUFA4的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展[16]。MAFG-AS1通過調(diào)節(jié)miR-744-5p/MAFG軸促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞增殖[17]。而在乳腺癌中，MAFG-AS1通過調(diào)節(jié)miR-339-5p/基質(zhì)金屬蛋白酶15（matrix metalloproteinase 15，MMP15）促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲性[18]。GC中MAFG-AS1表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)水平與腫瘤臨床分期提高，浸潤深度加深和患者生存期短密切相關(guān)；敲低MAFGAS1表達(dá)可抑制GC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[12]，這一結(jié)果與本研究結(jié)果一致。本研究中，通過分析GEPIA數(shù)據(jù)庫和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，MAFG-AS1在GC中表達(dá)失調(diào)，并與患者不良預(yù)后相關(guān)；進(jìn)一步研究表明，過表達(dá)MAFG-AS1可促進(jìn)GC細(xì)胞的增殖和遷移，這表明MAFG-AS1在GC中發(fā)揮促癌作用。

MiRNAs是一種在許多生物學(xué)進(jìn)程中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼RNA，miRNAs通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)和下游重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性，參與調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲、分化和凋亡[19-20]。有研究表明，miR-143-3p可通過靶向結(jié)合mRNA的3’-UTR在腫瘤中發(fā)揮抑制作用，如miR-143-3p通過靶向結(jié)合FOSL2（Foslike antigen 2）抑制骨肉瘤的增殖、遷移和侵襲[19]。類似研究表明，miR-143-3p通過靶向結(jié)合K-RAS抑制胰腺導(dǎo)管腺癌的發(fā)生[20]。乳腺癌中，miR-143-3p通過靶向絲裂原活化蛋白激酶7（mitogen-activate protein kinase 7，MAPK7）抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[21]。而在GC中miR-143-3p表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)失調(diào)與患者是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，功能上miR-143-3p通過靶向結(jié)合AKT2抑制GC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[22]。本研究中同樣發(fā)現(xiàn)，miR-143-3p在GC組織中表達(dá)下調(diào)，隨后通過驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)miR-143-3p通過靶向AKT2在GC細(xì)胞的增殖和遷移中發(fā)揮抑制作用。

AKT2屬于AKT家族，是一種常見致癌基因，其在調(diào)節(jié)血管生成、腫瘤生長、細(xì)胞轉(zhuǎn)移和化學(xué)抗性中發(fā)揮重要作用[23]。有研究提示，AKT2可促進(jìn)卵巢癌中丙酮酸激酶的表達(dá)，從而誘導(dǎo)體外細(xì)胞的遷移和侵襲，以及體內(nèi)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[24]。在乳腺癌中，AKT2通過調(diào)節(jié)F-肌動(dòng)蛋白和波形蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的生長、浸潤和肺轉(zhuǎn)移[25]。而在GC中，AKT2表達(dá)上調(diào)，敲低AKT2表達(dá)可抑制GC細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)其凋亡，且AKT2的表達(dá)受到miR-143-3p的靶向調(diào)控[22]。本研究中，再次驗(yàn)證提示miR-143-3p負(fù)調(diào)控AKT2的表達(dá)，MAFG-AS1正向調(diào)控的AKT2水平，這表明MAFG-AS1通過調(diào)控miR-143-3p/AKT2調(diào)控軸在GC進(jìn)展中發(fā)揮作用。

總之，本研究中發(fā)現(xiàn)MAFG-AS1在GC中的表達(dá)水平上調(diào)，并預(yù)示著GC患者的不良預(yù)后。進(jìn)一步研究表明，MAFG-AS1可促進(jìn)GC細(xì)胞的增殖和遷移。相關(guān)機(jī)制研究表明，MAFGAS1可通過調(diào)控miR-143-3p/AKT2軸在GC的進(jìn)展中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果為GC發(fā)病機(jī)制提供了新的見解，將有助于GC的早期診斷和治療。然而，本研究仍有許多不足之處，研究局限于單中心樣本，將來需要更大的樣本來證實(shí)這一結(jié)論。