李玖明，崔凱颯，王 雪，黃朝暉

結(jié)腸癌作為臨床常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)[1]。結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳學(xué)、表觀遺傳學(xué)以及腫瘤微環(huán)境等多個(gè)因素的調(diào)控。在生物體中，通?？筛鶕?jù)其是否具備蛋白編碼功能將RNA分為編碼RNA及非編碼RNA。近年研究已證實(shí)，非編碼RNA并非是基因轉(zhuǎn)錄的“噪音”，而是具有重要的生物學(xué)功能[2]。其中長(zhǎng)度＞200 bp的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）廣泛存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。LncRNA可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控生理、病理過(guò)程，不僅影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移和凋亡等功能，還在疾病的診斷和治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

有研究發(fā)現(xiàn)，Linc00355在胃癌中表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）通路促進(jìn)細(xì)胞增殖[3]。在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)的Linc00355可通過(guò)調(diào)控微RNA（microRNA，miR）-195/HOXA10信號(hào)軸促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[4]。但Linc00355在結(jié)腸癌中的功能和機(jī)制目前尚不清楚。

本研究基于腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）等數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)Linc00355在腫瘤中表達(dá)顯著上調(diào)，并可能是一個(gè)結(jié)腸癌潛在的新預(yù)后指標(biāo)。通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)與Linc00355相關(guān)的靶基因，進(jìn)行基因本體（Gene Ontology，GO）功能富集分析，預(yù)測(cè)Linc00355在結(jié)腸癌中的功能以及分子調(diào)控機(jī)制，并通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步探討Linc00355對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，以期為結(jié)腸癌的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器

結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心。DMEM購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，胰蛋白酶、青霉素/鏈霉素購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，LipofectAMINE 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。CCK-8購(gòu)自日本Dojindo公司，RNAiso和PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR PCR Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。Linc00355小干擾及陰性對(duì)照購(gòu)自中國(guó)吉瑪基因公司。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器（型號(hào)：SLAN-96P）為上海宏石醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品，光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：EVOS M7000）為美國(guó)賽默飛公司產(chǎn)品，全自動(dòng)酶標(biāo)儀（型號(hào)：Bio-Tek ELX800）為美國(guó)寶特公司產(chǎn)品。

1.2 生物信息學(xué)分析

首先從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載473例結(jié)腸癌患者（包括473例癌組織及41例配對(duì)的癌旁正常組織）測(cè)序數(shù)據(jù)及患者臨床資料。首先將下載的數(shù)據(jù)整理成基因表達(dá)矩陣文件，利用R語(yǔ)言EdgeR包對(duì)樣本分別進(jìn)行LncRNA在腫瘤中的差異分析，選取差異表達(dá)P＜0.05且|Log2Fold Change，Log2FC|＞2的基因作為差異表達(dá)LncRNA用于后續(xù)分析。利用基因表達(dá)綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）芯片數(shù)據(jù)庫(kù)（GSE23878、GSE41328和GSE39582）中Linc00355的表達(dá)數(shù)據(jù)繪制差異表達(dá)圖，并根據(jù)臨床信息進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析并繪制生存曲線。進(jìn)一步采用共表達(dá)方法預(yù)測(cè)Linc00355的靶基因。利用R語(yǔ)言Limma包對(duì)表達(dá)矩陣分析，篩選與Linc00355表達(dá)具有相關(guān)性的mRNA（P＜0.05，相關(guān)系數(shù)R＞0.3）。利用GEO芯片數(shù)據(jù)庫(kù)（GSE38832）中Linc00355、黑色素瘤抗原A3（melanoma antigen-A3，MAGE-A3）和周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制因子CDKN1A的表達(dá)數(shù)據(jù)繪制相關(guān)性散點(diǎn)圖（P＜0.05，相關(guān)系數(shù)R＞0.3）。最后使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)54個(gè)與Linc00355相關(guān)的mRNA進(jìn)行GO功能富集分析。使用R語(yǔ)言Ggplot2包進(jìn)行可視化作圖。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HCT116細(xì)胞使用含10% FBS、100 mg/L青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁且占滿(mǎn)培養(yǎng)皿底面積的80%～90%時(shí)傳代。HCT116細(xì)胞用胰蛋白酶消化傳代后，按3×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中。根據(jù)LipofectAMINE 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)分別將陰性對(duì)照siRNA（siNC）和2條針對(duì)Linc00355的siRNA（siLinc00355-1和siLinc00355-2）轉(zhuǎn)入HCT116細(xì)胞中。siNC正義鏈序列為5’-UUCUUCGAAGGUGUCACGUTT-3’，反義鏈序列為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’；siLinc00355-1正義鏈序列為5’-CCACUGACAGCAGAGUCUUTT-3’，反義鏈序列為5’-AAGACUGCUGUCAGUGGTT-3’；siLinc00355-2正義鏈序列為5’-GGGAAACUCUCUACGCUAUTT-3’，反義鏈序列為5’-AUAGCGUAGAGAGUUUCCCTT-3’。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

收集HCT116細(xì)胞（5×106個(gè)），用PBS清洗3遍，采用RNAiso試劑盒提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，以β-actin基因作為內(nèi)參照；PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 30 s、95 ℃5 s、60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以2－ΔΔCt值表述目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。β-actin基因上游引物序列為5’-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3’，下游引物序列為5’-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’，Linc00355上游引物序列為5’-GCAGACAGTTGTATCACGCC-3’，下游引物序列為5’-TCCGGAAGGTTGAGTGGTTG-3’；MAGE-A3基因上游引物序列為5’-GGCAGGCCTCCTGATAATCG-3’，下游引物序列為5’-GGTGAGCAGCTTCTTGGGAT-3’；CDKN1A（p21）基因上游引物序列為5’-TCTAGGAGGGAGACACTGGC-3’，下游引物序列為5’-TGTCTGACTCCTTGTTCCGC-3’。

1.5 CCK-8法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力

HCT116細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染siNC、siLinc00355-1和siLinc00355-2 24 h后收集3組細(xì)胞，以2×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，分別于1、2、3、4和5 d時(shí)加入CCK-8試劑，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀波長(zhǎng)450 nm處檢測(cè)各孔細(xì)胞的D值，并繪制細(xì)胞增殖曲線，具體檢測(cè)流程參閱試劑盒操作說(shuō)明。

收集上述轉(zhuǎn)染24 h后對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，以1×103個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，靜置培養(yǎng)7～14 d。用10%甲醛溶液固定細(xì)胞30 min后，加入1%的結(jié)晶紫染色20 min，計(jì)數(shù)每個(gè)孔內(nèi)的克隆數(shù)并拍照記錄（每個(gè)克隆含有50以上的細(xì)胞，直徑為0.3～1.0 mm）。

1.6 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的遷移及侵襲能力

收集上述轉(zhuǎn)染24 h后的3組細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，以1×105個(gè)/室的密度接種于Transwell小室的上室中，并在Transwell下室中加1 mL完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后除去培養(yǎng)液，用10%甲醛溶液固定細(xì)胞20 min，加入0.1%結(jié)晶紫染色20 min。清水沖洗去除染色液，用棉簽擦去未穿過(guò)小室膜的細(xì)胞。在倒置光學(xué)顯微鏡下（放大倍數(shù)為100倍）計(jì)數(shù)穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)，分析細(xì)胞的遷移能力。

Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)，在Transwell小室的上室中預(yù)先鋪設(shè)Matrigel，其余檢測(cè)流程同Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)，Transwell小室的上室中接種3組細(xì)胞48 h后，在倒置光學(xué)顯微鏡下（放大倍數(shù)為100倍）計(jì)數(shù)穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)，分析細(xì)胞的侵襲能力。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理研究數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以表示，各實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，多組間均數(shù)比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)）。組內(nèi)兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson線性相關(guān)分析；采用COX多因素回歸分析結(jié)腸癌患者死亡的影響因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌中差異表達(dá)的lncRNA

在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載基因表達(dá)矩陣文件并提取結(jié)腸癌患者的臨床信息；lncRNA的數(shù)據(jù)（包括473例癌組織及41例配對(duì)癌旁正常組織），利用R語(yǔ)言edgeR包，根據(jù)差異倍數(shù)|Log2FC|＞2和校正P＜0.05篩選出差異表達(dá)的lncRNA。熱圖（圖1A）和火山圖（圖1B）分析結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，在結(jié)腸癌中有871個(gè)lncRNA表達(dá)上調(diào)（圖中紅色標(biāo)注）和259個(gè)lncRNA表達(dá)下調(diào)（圖中綠色標(biāo)注）。

在這些差異表達(dá)的lncRNA中，根據(jù)生存分析篩選后發(fā)現(xiàn)，Linc00355表達(dá)與結(jié)腸癌患者不良預(yù)后相關(guān)，且在結(jié)腸癌中的功能未知，故選擇Linc00355進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 Linc00355表達(dá)的預(yù)后價(jià)值

利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的3組芯片（GSE23878、GSE41328和GSE39582）數(shù)據(jù)分析Linc00355在結(jié)腸癌中的表達(dá)和預(yù)后情況。結(jié)果（圖2A、圖2B和圖2C）顯示，Linc00355在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)（P＜0.01，P＜0.01和P＜0.05）。

對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得的447例結(jié)腸癌（剔除26例信息不全數(shù)據(jù)）分析結(jié)果顯示，Linc00355表達(dá)水平與患者的TNM分期成正相關(guān)（P＜0.0001）（圖2D），且Linc00355高表達(dá)患者的總生存期（overall survival，OS）（圖2E）和疾病特異性生存期（disease-specific survival，DSS）（圖2F）均明顯縮短（P值均＜0.05），GSE39583數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源的患者同樣顯示（圖2F），Linc00355高表達(dá)者的OS明顯縮短（P＜0.05）。

采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中Linc00355表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果（表1）顯示，結(jié)直腸癌組織中Linc00355表達(dá)與患者性別、年齡、T分期均無(wú)顯著相關(guān)性（P值均＞0.05），但與患者的臨床N、M分期及病理TNM分期有顯明顯的相關(guān)性（P＜0.01）。

COX多因素風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果（表2）顯示，Linc00355是結(jié)腸癌患者生存期的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，其表達(dá)水平越高，患者的OS期越短[風(fēng)險(xiǎn)比（hazard ratio，HR）＝1.601，95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）為1.008～2.542，P＝0.046]。此外，年齡和T分期也是結(jié)腸癌患者OS期的影響因素。

2.3 Linc00355共表達(dá)mRNA網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與GO功能富集分析

為了探究Linc00355影響患者預(yù)后的原因，通過(guò)共表達(dá)分析預(yù)測(cè)與Linc00355相關(guān)的mRNA，共發(fā)現(xiàn)54個(gè)mRNA與Linc00355表達(dá)有相關(guān)性（圖3A），相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。對(duì)這些基因進(jìn)行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因富集于如p53的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞蛋白分解代謝過(guò)程，泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性、蛋白質(zhì)乙?；⒌鞍踪|(zhì)小泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）化和細(xì)胞衰老等信號(hào)通路（圖3B）。這一結(jié)果提示，Linc00355在結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲等過(guò)程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。

Fig.1 Differentially expressed long non-coding RNA (lncRNA) in colon cancer based on The Cancer Genome Atlas (TCGA) dataset.A:Heat map of differentially expressed lncRNAs in colon cancer of TCGA database;B:Volcano map of differential lncRNA in colon cancer (red indicates up-regulation,green indicates down-regulation).logFC:Log2Fold change;FDR:False discover rate.圖1 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)獲得結(jié)腸癌中差異表達(dá)的lncRNA（A為熱圖；B為火山圖；紅色代表在癌組織中表達(dá)上調(diào)，綠色代表在癌組織中表達(dá)下調(diào)）

Fig.2 The correlation between Linc00355 expression and the prognosis of colon cancer patients.A-C:Linc00355 was up-regulated in tumor tissues compared with normal tissues in colon cancer cohorts of The Cancer Genome Atlas (TCGA) database (A) and Gene Expression Omnibus (GEO) database [GSE23878 (B)and GSE41328 (C)];D:Linc00355 expression was related to TNM stage;E-G:Survival analyses based on the expression of Linc00355 in the colon cancer cohorts of TCGA [overall survival (OS) (E) and disease-specific survival (DSS) (F)]and GSE39582 [OS (G)].圖2 采用TCGA及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)分析Linc00355表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性

2.4 Linc00355對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果（圖4A）顯示，與對(duì)照組比較，siLinc00355-1和siLinc00355-2組HCT116細(xì)胞中Linc00355的表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P值均＜0.001），提示2條siRNA均可有效沉默Linc00355的表達(dá)。

CCK-8法（圖4B）和克隆形成實(shí)驗(yàn)（圖4C）檢測(cè)結(jié)果顯示，敲低Linc00355表達(dá)后，siLinc00355-1和siLinc00355-2組HCT116細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.001）。

Transwell小室法檢測(cè)結(jié)果（圖4D）顯示，敲低Linc00355表達(dá)后，HCT116細(xì)胞的遷移和侵襲能力均明顯降低（P值均＜0.001）。

上述結(jié)果提示Linc00355可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。

表1 Linc00355表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性Table 1 Correlation between Linc00355 expression and the clinicopathological characteristics of patients with colon cancer Total＝447,n

表2 多因素COX風(fēng)險(xiǎn)模型分析Linc00355表達(dá)與結(jié)腸癌患者OS期的關(guān)系Table 2 Multivariate COX risk model analysis of the relationship between the expression of Linc00355 and the overall survival (OS) of patients with colon cancer

Fig.3 Analysis of mRNA co-expressed network of Linc00355 and Gene Ontology (GO) function enrichment analysis.A:Co-expression network of Linc00355;B:GO enrichment analysis of Linc00355 coexpressed genes.圖3 Linc00355共表達(dá)mRNA網(wǎng)絡(luò)（A）與GO功能富集分析結(jié)果圖（B）

表3 前20條Linc00355相關(guān)的共表達(dá)mRNATable 3 Linc00355 co-expression related mRNAs (TOP20)

Fig.4 Silencing Linc00355 expression inhibits the proliferation,migration and invasion of colon cancer HCT116 cells.A:The expression level of Linc00355 in HCT116 cells transfected with siRNA targeting Linc00355 (siLinc00355-1 and siLinc00355-2) was detected by real-time fluorescent quantitative PCR,the expression level of Linc00355 was significantly reduced;B-C:The cell proliferation was detected by CCK-8 (B) and clone formation method (C),the cell proliferation ability was significantly reduced in Linc00355 knockdown HCT116 cells;D:The cells migration and invasion abilities were detected by Transwell method,the cells migration and invasion abilities were inhibited in Linc00355 knockdown HCT116 cells.HCT116 cells were transfected with negative control (NC)-siRNA (siNC) as the control.***P＜0.001 (n=3).圖4 沉默Linc00355表達(dá)抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力

2.5 Linc00355可能通過(guò)調(diào)控MAGE-A3基因影響p53信號(hào)通路

為了驗(yàn)證上述共表達(dá)分析結(jié)果，選擇評(píng)分最高的MAGE-A3及其下游靶基因CDKN1A（p53通路關(guān)鍵信號(hào)分子）進(jìn)行了驗(yàn)證?；贕SE38832數(shù)據(jù)集分析發(fā)現(xiàn)，Linc00355與MAGE-A3的表達(dá)存在顯著正相關(guān)（R＝0.552 3，P＜0.000 1）（圖5A），而與CDKN1A的表達(dá)水平則呈顯著負(fù)相關(guān)（R＝－0.406 8，P＜0.001）（圖5B）。

Fig.5 The relationship between Linc00355,melanoma antigen (MAGE)-A3 and CDKN1A.A:Linc00355 was positively correlated with the expression of MAGE-A3 in colon cancer (R=0.552 3,P＜0.000 1);B:Linc00355 was negatively correlated with the expression of CDKN1A (R=-0.406 8，P＜0.001);C.Silencing Linc00355 expression could inhibit the expression of MAGE-A3 and promote the expression of CDKN1A.***P＜0.001 (n=3).圖5 Linc00355與MAGE-A3和CDKN1A mRNA表達(dá)的相關(guān)性

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果（圖5C）顯示，與對(duì)照組比較，2個(gè)敲低Linc00355表達(dá)組HCT116細(xì)胞中MAGE-A3 mRNA的表達(dá)水平均明顯下調(diào)（P值均＜0.001），而CDKN1A mRNA的表達(dá)水平均明顯上調(diào)（P值均＜0.001）。

上述結(jié)果提示，Linc00355可能通過(guò)影響MAGE-A3基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控抑癌因子p21的表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。

3 討論

結(jié)腸癌是全球第3大常見(jiàn)的惡性腫瘤，居腫瘤相關(guān)死因第2位。據(jù)2020年統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，將有超過(guò)190萬(wàn)例新增結(jié)直腸癌病例和935 000例死亡病例，約占癌癥新發(fā)和死亡病例的10%[5]。研究表明。LncRNA的失調(diào)可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥及多種生物學(xué)表型相關(guān)[6]。呂夢(mèng)佳等[7]發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌患者血漿中l(wèi)ncRNA MALAT1的表達(dá)水平明顯下調(diào)，lncRNA-ATB的表達(dá)明顯上調(diào)，血漿MALAT1及ATB可作為非小細(xì)胞肺癌的診斷指標(biāo)。曾明曦等[8]發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中l(wèi)ncRNA RP11-513G11.1的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織及正常胃組織，與胃癌患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分化及生存狀態(tài)顯著相關(guān)。

LncRNA作為結(jié)腸癌生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛能同樣不容忽視。SVOBODA等[9]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌患者血液中的lncRNA HOTAIR的表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照，且血液中HOTAIR的表達(dá)水平與患者的TNM分期、組織學(xué)分級(jí)以及OS期均有相關(guān)性。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中高表達(dá)的lncRNA FEZF1-AS1通過(guò)結(jié)合并促進(jìn)丙酮酸激酶2蛋白的穩(wěn)定性，從而調(diào)控糖酵解和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[10]。并發(fā)現(xiàn)lncRNA UCA1和Linc00152分別通過(guò)調(diào)控miR-204-5p和miR-139-5p的表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌的增殖和化療耐藥[11]。此外，還發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG6在結(jié)直腸癌中發(fā)揮促癌作用，且SNHG6的表達(dá)可作為一個(gè)新的不良預(yù)后指標(biāo)[12]。

本研究首次發(fā)現(xiàn)，Linc00355可能是與結(jié)腸癌預(yù)后相關(guān)的新生物標(biāo)志物。Linc00355在結(jié)腸癌組織呈現(xiàn)高表達(dá)，并與患者的不良預(yù)后相關(guān)；沉默Linc00355的表達(dá)水平體外可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，提示Linc00355在結(jié)腸癌中發(fā)揮癌基因功能。隨后，基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及信號(hào)通路富集提示，Linc00355可能與細(xì)胞蛋白分解代謝、蛋白質(zhì)泛素化、乙?；⑻K木化，p53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞衰老等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程相關(guān)。而蛋白質(zhì)修飾、p53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞衰老與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。本研究中進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，沉默Linc00355表達(dá)可上調(diào)MAGE-A3 mRNA的表達(dá)水平。有研究表明，MAGE-A3可通過(guò)調(diào)控p53抑癌因子，影響p21、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）及Bax的表達(dá)并調(diào)控與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的信號(hào)通路[13]。上述結(jié)果提示，Linc00355可能通過(guò)MAGE-A3基因影響p53信號(hào)通路進(jìn)而影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。關(guān)于Linc00355調(diào)控結(jié)腸癌發(fā)生和發(fā)展的具體功能及機(jī)制的深入尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本文結(jié)果提示Linc00355有望成為一種新的結(jié)腸癌患者的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。