周逢海，呂海迪，周 川，張曉峰，張 發(fā)

胚胎致死性異常視覺（embryonic lethal abnormal vision，ELAV）家族成員中的人抗原R（human antigen R，HuR）即為ELAVL1蛋白，其是一種RNA結(jié)合蛋白，在正常細(xì)胞中主要分布于細(xì)胞核中，當(dāng)其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)中時(shí)即能夠與mRNA結(jié)合促進(jìn)目的蛋白的表達(dá)[1]。HuR廣泛表達(dá)于包括小腸、脾臟和卵巢等組織中，通過轉(zhuǎn)錄后機(jī)制參與細(xì)胞中許多分子的調(diào)控表達(dá)[2]。然而，其他家族成員HuB、HuC和HuD幾乎只表達(dá)在神經(jīng)組織中，參與相關(guān)分子的表達(dá)調(diào)控[2]。

研究表明，ELAVL1基因與腫瘤的多種生物學(xué)行為有關(guān)；與癌旁組織或正常組織相比，ELAVL1在結(jié)直腸癌、肺癌、乳腺癌和肝癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，且主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中[2-7]。ELAVL1通過與腫瘤生物學(xué)功能有關(guān)的多種分子的mRNA相結(jié)合從而促進(jìn)蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞多種生物學(xué)功能包括細(xì)胞增殖、周期、凋亡和侵襲等，甚至還與腫瘤細(xì)胞的放化療耐受相關(guān)，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[2-7]。然而，當(dāng)前有關(guān)ELAVL1在前列腺癌中的表達(dá)及作用鮮有報(bào)道。已有的研究同樣發(fā)現(xiàn)，與正常前列腺組織相比，ELAVL1在前列腺癌組織中高表達(dá)且主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中[8]，初步研究表明高表達(dá)的ELAVL1與前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，但機(jī)制如何仍缺乏深入的研究。

本研究中將攜帶有特異性針對(duì)ELAVL1基因的ELAVL1-shRNA（shELAVL1）重組腺病毒載體導(dǎo)入前列腺癌PC-3細(xì)胞內(nèi)從而實(shí)現(xiàn)ELAVL1 mRNA和蛋白的特異性沉默，并在此基礎(chǔ)上通過檢測細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞周期，從而觀察ELAVL1對(duì)PC-3細(xì)胞生長的作用；之后通過檢測與上述生物學(xué)作用相關(guān)的蛋白分子及腫瘤經(jīng)典信號(hào)通路磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）中的蛋白分子實(shí)現(xiàn)初步的機(jī)制探究；最后利用PC-3細(xì)胞構(gòu)建裸鼠移植瘤模型，并給予瘤內(nèi)注射攜帶有ELAVL1-shRNA的重組腺病毒，觀察沉默ELAVL1基因表達(dá)對(duì)移植瘤生長的影響，進(jìn)一步通過體內(nèi)研究證實(shí)ELAVL1對(duì)前列腺癌生長的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1和前列腺癌PC-3細(xì)胞均購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫/干細(xì)胞庫。BALB/c-nu裸鼠、4～5周齡、雄性、體質(zhì)量為15～18 g購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002）]。

1.2 試劑和儀器

攜帶有特異性針對(duì)ELAVL1基因的shRNA（shELAVL1）的復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad5-shELAVL1-GFP和對(duì)照空載體病毒Ad5-GFP由本課題組前期構(gòu)建獲得[9]。RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液和青霉素鏈霉素雙抗購自美國HyClone公司，RWPE-1細(xì)胞專用培養(yǎng)液PEpiCM購自美國ScienCell研究實(shí)驗(yàn)室，胎牛血清和0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司，二甲亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司。兔抗人ELAVL1單克隆抗體、兔抗人環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，Cox-2）多克隆抗體、兔抗人細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）多克隆抗體、兔抗人AKT單克隆抗體，兔抗人磷酸化-AKT（phospho-AKT，p-AKt）多克隆抗體和兔抗人PI3K多克隆抗體購自英國Abcam公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TEMED、電化學(xué)發(fā)光試劑、30%丙烯酰胺、10% SDS溶液和Triton X-100等均購自北京索萊寶科技有限公司；PVDF膜購自美國Merck Millipore公司；Alexa Fluor 594標(biāo)記的羊抗兔IgG購自美國Invitrogen公司；DAPI細(xì)胞染色液購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。CCK-8試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，碘化丙啶（propidium iodide，PI）和RNaseA購自美國Sigma公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR擴(kuò)增試劑盒均購自東洋紡（上海）生物科技有限公司。

凝膠成像分析系統(tǒng)（型號(hào)：ChemiDoc-It2）為美國UVP公司產(chǎn)品，倒置光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：CKX31）為日本Olympus公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀（FACSVerse）為美國BD公司產(chǎn)品，酶聯(lián)免疫檢測儀（型號(hào)：Infinite 200）為瑞士TECAN公司產(chǎn)品,熒光顯微鏡（型號(hào)：MF43）為美國Advanced Microscopy公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測PC-3細(xì)胞和RWPE-1細(xì)胞中ELAVL1 mRNA的表達(dá)水平

收集前列腺癌PC-3和前列腺正常上皮細(xì)胞RWPE-1，用TRIzol試劑提取細(xì)胞的總RNA并反轉(zhuǎn)為cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：按5×Reverse Transcription Buffer 2 μL、OligdT引物1 μL、RNA 1 μg和MMLV RTase 0.5 μL的比例配制反應(yīng)液，用DEPC處理后的ddH2O補(bǔ)充至10 μL；反應(yīng)條件為37 ℃ 20 min，95 ℃ 5min。反轉(zhuǎn)錄完成后，以此cDNA為模板，按照2×Realtime PCR Master Mix 5 μL、2條引物各0.4 μL、cDNA 0.1 μL、加ddH2O補(bǔ)充至10 μL的比例配制PCR反應(yīng)體系；擴(kuò)增條件為95 ℃ 3 min；94℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s、65 ℃ 60 s、97 ℃ 1 s。引物序列見表1。反應(yīng)結(jié)束后，用PCR軟件生成擴(kuò)增曲線和溶解曲線，定量PCR并對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢PC-3及RWPE-1細(xì)胞中ELAVL1蛋白的表達(dá)水平

將PC-3及RWPE-1細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)，收集細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白；行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將分離后的蛋白條帶電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉處理2 h，加入一抗[兔抗人ELAVL1單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶500）和鼠抗人β-actin單克隆抗體（內(nèi)參照）（體積稀釋比例為1∶1 000）]室溫孵育2 h；TBST洗膜（8 min/次×3次），隨后加入二抗[辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（體積稀釋比例為1∶1 000）或辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（體積稀釋比例為1∶1 000）]均室溫孵育1 h；TBST洗膜（8 min/次×3次），滴加電化學(xué)發(fā)光液后于發(fā)光成像儀中顯影。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測PC-3及RWPE-1細(xì)胞中ELAVL1蛋白的表達(dá)水平并定位

將PC-3和RWPE-1細(xì)胞接種于直徑為3.5 cm的培養(yǎng)皿中蓋玻片進(jìn)行細(xì)胞爬片，細(xì)胞生長至融合度為70%時(shí)，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞（3 min/次×3次）；滴入4%多聚甲醛溶液室溫下固定10 min，PBS清洗（3 min/次×3次）；用3%雙氧水室溫下進(jìn)行孵育10 min；加入含1%胎牛血清白蛋白非特異性抗原（150 μL）封閉處理10～15 min；滴加一抗[兔抗人ELAVL1單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶100）]50 μL，4 ℃下濕盒孵育過夜。PBS清洗3遍后滴加二抗，室溫條件下孵育1 h。PBS清洗（4 min/次×2次）后DAB顯色。常規(guī)處理后，中性樹脂進(jìn)行封片，放于顯微鏡下進(jìn)行蛋白定位觀察。

1.6 免疫熒光法檢測PC-3和RWPE-1細(xì)胞中ELAVL1蛋白的定位

將PC-3和RWPE-1細(xì)胞接種于直徑為3.5 cm的培養(yǎng)皿中蓋玻片進(jìn)行細(xì)胞爬片，細(xì)胞生長至融合度為70%時(shí)，去除細(xì)胞培養(yǎng)液，隨后用PBS清洗細(xì)胞（3 min/次×3次），加入4%多聚甲醛室溫下固定10 min，用PBS清洗細(xì)胞（3 min/次×3次）；加入0.5% TritonX-100適量保證覆蓋載玻片持續(xù)5 min，進(jìn)行細(xì)胞膜通透。用PBS清洗細(xì)胞（3 min/次×3次），加入封閉液1～2 mL處理1.5 h進(jìn)行非特異性抗原封閉。向培養(yǎng)皿中加入一抗[兔抗人ELAVL1單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶100）]1 mL，常溫下反應(yīng)2 h。BS清洗細(xì)胞（3 min/次×4次），加入用PBS稀釋后的二抗（Alexa Fluor 594標(biāo)記的羊抗兔IgG）1 mL，避光常溫下反應(yīng)2 h。PBS清洗后加入DAPI染色液染細(xì)胞核，靜置3 min后，在載玻片上滴加甘油并用蓋玻片進(jìn)行封片，置于熒光顯微鏡下觀察ELAVL1蛋白的定位情況。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 The primer sequence of real-time fluorescent quantitative PCR

1.7 蛋白印跡檢測感染重組腺病毒Ad5-shELAVL1-GFP后PC-3細(xì)胞中ELAVL1蛋白的沉默效率

將PC-3細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)板中，1 d后待其融合度為60%～70%時(shí)，將重組腺病毒Ad5-shELAVL1-GFP及空載體腺病毒Ad5-GFP，按照感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）＝300感染PC-3細(xì)胞（以未用任何藥物處理的PC-3細(xì)胞作為空白對(duì)照組）；8 h后更換為新鮮完全培養(yǎng)液繼續(xù)置于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，隨后收集各組細(xì)胞并提取總蛋白。采用蛋白質(zhì)印跡法檢測ELAVL1蛋白的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)流程同1.4節(jié)。

1.8 CCK-8檢測沉默ELAVL1表達(dá)對(duì)PC-3細(xì)胞增殖能力的影響

用胰蛋白酶消化PC-3細(xì)胞后收集細(xì)胞，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)并調(diào)整PC-3細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，隨后在96孔板接種100 μL/孔細(xì)胞（1×104個(gè)細(xì)胞），第2天待細(xì)胞融合度在50%～70%時(shí)按照MOI＝300對(duì)每孔分別進(jìn)行病毒感染。實(shí)驗(yàn)分組同1.6節(jié)，分為空白對(duì)照組、Ad5-shELAVL1-GFP組和對(duì)照空載體腺病毒Ad5-GFP組，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔；病毒感染8 h后更換為新鮮的完全培養(yǎng)液，分別于第0、24、36、48和72 h時(shí)取所需檢測的樣品測孔中加入10 μL CCK-8溶液，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h，最后在酶標(biāo)免疫檢測儀波長450 nm處檢測各孔的D值，并以時(shí)間-D值繪制生長曲線。

1.9 FCM法檢測沉默ELAVL1表達(dá)對(duì)PC-3細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞的分組及處理同1.7節(jié)，病毒感染后第5天用胰蛋白酶消化細(xì)胞并收集于離心管（10 mL）中，離心除去上清液，加入4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌后，加入預(yù)冷的75%乙醇溶液固定細(xì)胞（置于－20 ℃冰箱過夜）。取出細(xì)胞再用4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌（5 min/次×2次）。將濃度為200 μg/mL的RNA酶0.2 mL加入其中，并在避光37 ℃條件下孵育30 min，之后加入PI（100 μg/mL）0.2 mL染色，室溫條件下避光進(jìn)行孵育30 min，之后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行周期的檢測。

1.10 蛋白質(zhì)印跡法檢測沉默ELAVL1表達(dá)對(duì)PC-3細(xì)胞中Cox-2、Cyclin D1、PI3K、AKT及p-AKT蛋白表達(dá)水平的影響

細(xì)胞的分組及處理同1.7節(jié)，病毒感染8 h后更換為新鮮的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。72 h后收集各組細(xì)胞并提取總蛋白，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測Cox-2、Cyclin D1、PI3K、AKT及p-AKT蛋白的表達(dá)水平，檢測流程同1.4節(jié)。一抗分別兔抗人ELAVL1單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶500）、兔抗人Cox-2多克隆抗體（體積稀釋比例為1∶500）、兔抗人cyclin D1多克隆抗體（體積稀釋比例為1∶500）、兔抗人PI3K多克隆抗體（體積稀釋比例為1∶300）、兔抗人AKT單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶200）、兔抗人p-AKT多克隆抗體（體積稀釋比例為1∶200），鼠抗人β-actin單克隆抗體（體積稀釋比例為1∶1 000），二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG（體積稀釋比例均為1∶1 000）。

1.11 前列腺癌PC-3細(xì)胞皮下移植瘤模型建立

裸鼠購買后于無特定病原體（specific pathogen-free，SPF）級(jí)環(huán)境中適應(yīng)飼養(yǎng)3 d。將PC-3細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度為70%時(shí)收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/mL。取100 μL（細(xì)胞數(shù)約為1×106個(gè)）細(xì)胞懸液采用注射的方法接種于裸鼠左側(cè)腹部皮下。2周后，以裸鼠左側(cè)腹部出現(xiàn)直徑＞5 mm的移植瘤提示裸鼠移植瘤構(gòu)建成功。

1.12 Ad5-shELAVL1-GFP抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞皮下移植瘤的生長

PC-3細(xì)胞接種2周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將移植瘤構(gòu)建成功的裸鼠共27只隨機(jī)分為3組，每組9只，采用瘤內(nèi)注射的方式分別給予0.9%氯化鈉溶液、重組腺病毒Ad5-shELAVL1-GFP及空載體腺病毒Ad5-GFP治療；每只裸鼠每次瘤內(nèi)注射腺病毒（病毒滴度為2×1011pfu/mL）50 μL，每周2次，連續(xù)2周。0.9%氯化鈉溶液作為空白對(duì)照組同樣按照上述給藥方式和劑量給藥。

首次給藥后每3 d一次記錄裸鼠移植瘤的長（a）短（b）徑，計(jì)算腫瘤體積并繪制腫瘤體積增長曲線，腫瘤體積＝1/2×a×b2。18 d后處死所有小鼠取出移植瘤稱重。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用表示。組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 ELAVL1 mRNA和蛋白在前列腺癌中的表達(dá)情況

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測結(jié)果（圖1A）顯示，正常前列腺正常上皮RWPE-1細(xì)胞和前列腺癌PC-3細(xì)胞中ELAVL1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.0±0.04和2.11±0.02，PC-3細(xì)胞中ELAVL1 mRNA的表達(dá)水平較RWPE-1細(xì)胞明顯上調(diào)（P＜0.001）。

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果（圖1B）同樣顯示，PC-3細(xì)胞中的ELAVL1蛋白的表達(dá)水平明顯高于RWPE-1細(xì)胞，差異具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

Fig.1 The expression levels of embryonic lethal abnormal vision (ELAVL1) mRNA and protein in normal prostate epithelial cells RWPE-1 and prostate cancer PC-3 cells were detected by real-time fluorescent quantitative PCR (A) and Western blotting (B),respectively.***P＜0.001,vs RWPE-1 cells (n=3).圖1 分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測ELAVL1 mRNA（A）及蛋白（B）在前列腺正常上皮RWPE-1細(xì)胞和前列腺癌PC-3細(xì)胞中的表達(dá)水平

上述結(jié)果說明，ELAVL1在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯提高。

2.2 ELAVL1蛋白在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)定位

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果（圖2A）顯示，RWPE-1細(xì)胞核中ELAVL1蛋白染色較深，細(xì)胞質(zhì)中染色較淺并且無ELAVL1蛋白染色顆粒，提示ELAVL1蛋白主要集中表達(dá)于細(xì)胞核中；而在PC-3細(xì)胞中，細(xì)胞核中該蛋白染色較淺，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯的蛋白染色顆粒提示ELAVL1蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。

免疫熒光法檢測結(jié)果（圖2B）顯示，正常前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞中ELAVL1蛋白的紅色熒光在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均出現(xiàn)，融合后的圖片顯示RWPE-1細(xì)胞核呈現(xiàn)紫色，細(xì)胞質(zhì)紅色熒光較淺，說明ELAVL1蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞核中，細(xì)胞質(zhì)中較少。而在前列腺癌PC-3細(xì)胞中，紅色熒光主要富集在細(xì)胞質(zhì)中，融合后圖片顯示細(xì)胞核仍為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)紅色熒光較亮，說明ELAVL1蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中。

Fig.2 The localization of embryonic lethal abnormal vision (ELAVL1) protein in normal prostate epithelial cells RWPE-1 and prostate cancer PC-3 cells were detected by immunohistochemical method (A,DAB,×400) and immunofluorescence (B,×400),respectively.圖2 分別采用免疫組織化學(xué)法（A，DAB，×400）和免疫熒光法（B，×400）檢測ELAVL1蛋白在正常前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞和前列腺癌PC-3細(xì)胞中的定位情況

2.3 沉默ELAVL1基因表達(dá)對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖能力的影響

PC-3細(xì)胞感染重組腺病毒Ad5-shELAVL1-GFP后，蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果（圖3A）顯示，與對(duì)照組相比，Ad5-shELAVL1-GFP組中ELAVL1蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.05）。這一結(jié)果提示，PC-3細(xì)胞中ELAVL1基因被有效的沉默。

CCK-8法檢測結(jié)果（圖3B）顯示，Ad5-shELAVL1-GFP組PC-3細(xì)胞的D值在0、24和36 h分別與Ad5-GFP組和空白對(duì)照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）；而在48和72 h時(shí)Ad5-shELAVL1-GFP組細(xì)胞的D值較Ad5-GFP組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。Ad5-GFP組和空白對(duì)照組在0、24、36、48和72 h的D值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）。以上結(jié)果說明，對(duì)照重組腺病毒空體載Ad5-GFP對(duì)PC-3細(xì)胞的增殖能力無明顯的影響，而在ELAVL1-shRNA沉默ELAVL1基因表達(dá)后0、24和36 h時(shí)抑制細(xì)胞增殖能力的作用不顯著，在48和72 h時(shí)其抑制細(xì)胞增殖能力的作用明顯提高。

2.4 沉默ELAVL1基因?qū)η傲邢侔㏄C-3細(xì)胞周期的影響

FCM法檢測結(jié)果（圖4）顯示，腺病毒空載體Ad5-GFP組PC-3細(xì)胞中G1期細(xì)胞所占的比例為（73.67%±1.41）%，明顯高于Ad5-shELAVL1-GFP組的（50.02±1.73）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而腺病毒空載體Ad5-GFP組中G2期細(xì)胞所占的比例為（6.19±0.35）%，明顯低于Ad5-shELAVL1-GFP組的（26.92±1.83）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；腺病毒空載體Ad5-GFP組中G1期細(xì)胞和G2期細(xì)胞所占的比例與空白對(duì)照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＞0.05）。

以上結(jié)果說明沉默ELAVL1基因能夠使得前列腺癌PC-3細(xì)胞周期被阻滯于G1期。

2.5 沉默ELAVL1基因表達(dá)對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞中Cox-2、cyclin D1、PI3K、AKT和p-AKT等蛋白表達(dá)水平的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測了各組PC-3細(xì)胞中ELAVL1、AKT、cyclin D1、p-AKT、Cox-2和PI3K蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果（圖5）顯示，與對(duì)照組空載體腺病毒Ad5-GFP組相比，重組腺病毒Ad5-shELAVL1-GFP組PC-3細(xì)胞中與細(xì)胞周期及增殖相關(guān)蛋白cyclin D1和Cox-2及與PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)的蛋白AKT、p-AKT和PI3K的表達(dá)水平均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均＜0.05）。這一結(jié)果說明，沉默ELAVL1基因表達(dá)后，AKT、PI3K、p-AKT、cyclin D1及Cox-2等蛋白的表達(dá)水平隨之下降，表明在腫瘤細(xì)胞PC-3中ELAVL1可能參與了調(diào)控細(xì)胞的增殖及周期，并涉及到PI3K/AKT信號(hào)通路。

Fig.3 The expression level of embryonic lethal abnormal vision-like 1 (ELAVL1) protein in prostate cancer PC-3 cells infected with recombinant adenovirus Ad5-shELAVL1-GFP was detected by Western blotting (A),the effect of silencing ELAVL1 gene on proliferation of PC-3 cells was detected by CCK-8 method (B).PC-3 cells were infected with adenovirus empty vector Ad5-GFP as the control;PC-3 cells were treated without any drugs as the blank control.*P＜0.05,vs Ad5-GFP group (n=3).圖3 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測PC-3細(xì)胞中ELAVL1蛋白的沉默效果（A）及CCK-8法檢測沉默ELAVL1基因表達(dá)對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的影響（B）

Fig.4 The effect of silencing embryonic lethal abnormal vision (ELAVL1) gene in PC-3 cells on cell cycle distribution was detected by FCM assay.PC-3 cells were treated without any drugs as the blank control,PC-3 cells were infected with adenovirus empty vector Ad5-GFP as the control.*P＜0.05 (n=3).圖4 沉默ELAVL1基因表達(dá)對(duì)PC-3細(xì)胞周期的影響

Fig.5 The effect of silencing embryonic lethal abnormal vision (ELAVL1) gene in PC-3 cells on the protein expressions of protein kinase B (PKB,also known as AKT),cyclin D1,phospho-AKT (p-Akt),cyclooxygenase-2 (Cox-2) and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) were detected by Western blotting.PC-3 cells were treated without any drugs as the blank control,PC-3 cells were infected with adenovirus empty vector Ad5-GFP as the control.*P＜0.05,vs Ad5-GFP group (n=3).圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測沉默ELAVL1基因表達(dá)對(duì)PC-3細(xì)胞中AKT、cyclin D1、p-AKT、Cox-2和PI3K蛋白表達(dá)的影響

2.6 重組腺病毒Ad5-shELAVL1-GFP對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞移植瘤的作用

Fig.6 The effect of intratumoral injection of recombinant adenoviral vector Ad5-shELAVL1-GFP on the growth of prostate cancer PC-3 cells xenografts in nude mice.A:Xenograft tumors on the 14th day after subcutaneous injection of PC-3 cells in the left abdomen of nude mice;B:Comparison of growth curves of xenograft tumors of PC-3 cells in nude mice.Xenograft tumors that were treated with 0.9% sodium chloride solution.C:On day 33,observation of xenograft tumors in nude mice treated with Ad5-shELAVL1-GFP,treated with 0.9% sodium chloride solution as the blank control,and treated with Ad5-GFP as the control.D:Comparison of the weight of xenograft tumors obtained from nude mice,treated with Ad5-shELAVL1-GFP,treated with 0.9% sodium chloride solution as the blank control,and treated with Ad5-GFP as the control.*P＜0.05,vs Ad5-GFP (n=9).圖6 瘤內(nèi)注射重組腺病毒Ad5-shELAVL1-GFP對(duì)裸鼠前列腺癌PC-3細(xì)胞移植瘤生長的影響

將PC-3細(xì)胞接種于裸鼠左側(cè)腹部皮下，14 d后在接種處出現(xiàn)圓形飽滿的移植瘤（圖6A），次日開始將重組腺病毒Ad5-shELAVL1-GFP、對(duì)照空載體腺病毒Ad5-GFP及0.9%氯化鈉溶液（空白對(duì)照組）進(jìn)行瘤內(nèi)注射。在瘤內(nèi)注射病毒期間，小鼠飲食、活動(dòng)能力、毛色和精神狀況均良好，移植瘤生長曲線結(jié)果顯示（圖6B），Ad5-shELAVL1-GFP組的裸鼠腫瘤生長速度與對(duì)照組相比明顯減緩（P＜0.05），而對(duì)照病毒組與空白對(duì)照組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第33天時(shí)對(duì)裸鼠荷瘤體積大體觀察（圖6C）可見，Ad5-shELAVL1-GFP組裸鼠的移植瘤較對(duì)照病毒組和空白對(duì)照組明顯縮小。對(duì)3組移植瘤標(biāo)本的稱重結(jié)果（圖6D）顯示，Ad5-shELAVL1-GFP組、對(duì)照病毒組和空白對(duì)照組移植瘤的質(zhì)量分別為（0.24±0.15）g、（0.67±0.21）g和（0.79±0.34）g，Ad5-shELAVL1-GFP組與對(duì)照病毒組和空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而對(duì)照組和空白對(duì)照組間則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

上述結(jié)果說明，沉默ELAVL1基因表達(dá)能夠減緩前列腺癌腫瘤的生長。

3 討論

已有的研究表明，前列腺癌組織中ELAVL1的表達(dá)水平明顯高于正常前列腺組織[8]。本研究中發(fā)現(xiàn)，前列腺癌PC-3細(xì)胞中ELAVL1蛋白的表達(dá)水平明顯高于正常前列腺上皮細(xì)胞RWPE-1，該結(jié)果符合前述前列腺癌臨床樣本的研究結(jié)果。另外以往研究中也已證實(shí)，在其他腫瘤中包括肝癌、乳腺癌和肺癌等，ELAVL1蛋白的表達(dá)水平高于正常組織[5,10-11]，本研究結(jié)果符合ELAVL1在其他腫瘤中的表達(dá)情況。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)ELAVL1在前列腺癌PC-3細(xì)胞中主要集中表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，而在RWPE-1中主要表達(dá)于細(xì)胞核上。ELAVL1蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，正常情況其主要位于細(xì)胞核中，在受到刺激后ELAVL1蛋白與目的mRNA結(jié)合穿梭至細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行調(diào)控，之后mRNA被釋放，ELAVL1返回細(xì)胞核[2]。因此，細(xì)胞質(zhì)中的ELAVL1才能真正發(fā)揮調(diào)控生物學(xué)的作用。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的ELAVL1主要集中于細(xì)胞質(zhì)，且這些細(xì)胞質(zhì)中的ELAVL1具有顯著促腫瘤作用[12-15]，由此可見細(xì)胞質(zhì)中ELAVL1的堆積是其促腫瘤作用的關(guān)鍵。本研究中發(fā)現(xiàn)，與RWPE-1細(xì)胞相比，高表達(dá)的ELAVL1在PC-3細(xì)胞中主要位于細(xì)胞質(zhì)中，初步推測與其他腫瘤一樣，ELAVL1對(duì)于前列腺癌發(fā)生和發(fā)展同樣具有促進(jìn)作用。

腫瘤的生長依賴于細(xì)胞積極的分裂，已有的研究報(bào)告顯示ELAVL1基因與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白包括cyclin D1、cyclin E1和cyclin A2等[16-18]，沉默ELAVL1基因表達(dá)后這些周期相關(guān)蛋白的表達(dá)均呈下降趨勢。如YUAN等[19]在乳腺癌中的研究發(fā)現(xiàn)ELAVL1基因被敲減后，腫瘤細(xì)胞的生長緩慢，cyclin D1的表達(dá)水平也呈下調(diào)趨勢。MURALIDHARAN等[20]在肺癌中的研究結(jié)果也同樣顯示，利用siRNA干擾技術(shù)沉默ELAVL1基因表達(dá)后，肺癌細(xì)胞的增殖能力被明顯抑制，cyclin D1和cyclin E的表達(dá)水平明顯減低。在前列腺癌的有關(guān)研究中，已經(jīng)有學(xué)者證實(shí)了Cox-2表達(dá)也與腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后差有關(guān)[21]。有關(guān)ELAVL1蛋白和Cox-2之間關(guān)系，有研究發(fā)現(xiàn)沉默ELAVL1基因表達(dá)可以引起Cox-2的表達(dá)下調(diào)[8]。本研究中同樣發(fā)現(xiàn)，沉默ELAVL1基因表達(dá)后PC-3細(xì)胞的生長被抑制，且細(xì)胞周期被阻滯于G1期；與細(xì)胞增殖有關(guān)的分子cyclin D1和Cox-2蛋白的表達(dá)水平下降。體內(nèi)裸鼠PC-3細(xì)胞移植瘤模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了，敲低ELAVL1基因表達(dá)后能夠抑制腫瘤的生長。上述研究結(jié)果充分說明，前列腺癌中高表達(dá)的ELAVL1可能是通過細(xì)胞周期促進(jìn)前列腺癌的發(fā)展。

腫瘤發(fā)生和發(fā)展的信號(hào)通路有很多，包括Janus激酶（janus kinase，JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路以及絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activate protein kinase，MAPK）通路等[22]，盡管目前許多研究證明了ELAVL1基因與多種腫瘤生物活動(dòng)相關(guān)的生物分子有關(guān)，但是目前有關(guān)詳細(xì)ELAVL1蛋白信號(hào)通路的研究報(bào)道不多，有學(xué)者在神經(jīng)膠質(zhì)瘤研究中認(rèn)為ELAVL1通過PKM2/ELAVL1/p27信號(hào)通路來促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[23]，也有學(xué)者在血液腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)ELAVL1影響鼠雙微體基因2（murine doubleminute 2，MDM2）-p53信號(hào)通路[24]。本研究中發(fā)現(xiàn)，沉默ELAVL1基因表達(dá)可導(dǎo)致PI3K/AKT信號(hào)通路中的PI3K、AKT和p-AKT蛋白表達(dá)水平下調(diào)，提示ELAVL1蛋白通過影響PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。然而，本研究未進(jìn)一步探究PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制是cyclin D1和Cox-2的表達(dá)下調(diào)的上游機(jī)制，但根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道在腫瘤PI3K/AKT信號(hào)通路中，其下游調(diào)控的分子包含cyclin D1和Cox-2[25-26]，因此推測ELAVL1蛋白可能通過PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)而調(diào)控cyclin D1和Cox-2表達(dá)從而影響PC-3細(xì)胞的生長。