張金玲，何 旭，黃吉燕

（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院口腔科，上海 200135）

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是臨床常見的一種口腔黏膜疾病，目前發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與遺傳、免疫等多種因素有關(guān)。OLP病理表現(xiàn)為上皮細(xì)胞固有層存在大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，因此OLP的發(fā)病機(jī)制與T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)密切相關(guān)［1-2］。輔助性T細(xì)胞 17（T helper cell 17，Th17）能通過釋放多種促炎因子如IL-17等參與免疫反應(yīng)，而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）能表達(dá)叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子 3（forkheadtranscription factor p3，F(xiàn)oxp3），通過釋放多種抗炎因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 -β1（Transforming Growth Factor-β1，TGF-β1）等發(fā)揮作用［3］。目前Th17/Treg平衡在多種自身免疫疾病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。多項(xiàng)研究表明，Th17和Treg細(xì)胞均參與了OLP發(fā)生和發(fā)展過程，但目前研究報(bào)道多圍繞病損組織中的表達(dá)，而對(duì)其在外周血中的表達(dá)及作用研究較少［4］。因此本次研究以我院收治的300例OLP患者為研究對(duì)象，探究糜爛性O(shè)LP患者外周血Th17/Treg表達(dá)水平及其對(duì)黏膜病損發(fā)展的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年1月～2019年2月我院收治的300例OLP患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者確診為OLP，參考《口腔扁平苔蘚診療指南（試行）》［5］，可分為糜爛型和非糜爛型：①非糜爛型OLP表現(xiàn)為白色斑紋、丘疹或伴隨輕度充血，體征評(píng)分≤2分，無明顯癥狀。②糜爛型OLP表現(xiàn)為白色網(wǎng)紋間和病損周圍伴隨充血萎縮糜爛，體征評(píng)分＞3分，伴有自發(fā)疼痛；（2）近期未使用過抗生素、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等藥物；（3）患者知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他免疫系統(tǒng)疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等；（2）合并牙周炎、白斑等其他口腔疾病或存在皮損等；（3）合并高血壓、糖尿病、等基礎(chǔ)代謝疾?。唬?）合并艾滋病、乙肝等感染性疾病。300例入選患者中糜爛型有124例，男54例，女70例，年齡（45.2±12.0）歲；非糜爛型有176例，其中男75例，女101例，年齡（44.8±11.7）歲，對(duì)照組150例，其中男63例，女87例，年齡（44.6±11.5）歲。各組患者年齡、性別等一般資料比較無顯著差異（P＞0.05）。本次研究提交我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核并通過。

1.2 方法入院后抽取患者及志愿者空腹靜脈血，離心取上清液，采用流式細(xì)胞儀（BD公司，F(xiàn)ACSCalibur型）檢測(cè)各組外周血Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞水平，采用ELISA檢測(cè)外周血IL-17、TGF-β1水平（試劑盒來自于美國(guó)RD公司），采用熒光定量PCR儀（美國(guó)伯樂公司，T100型）檢測(cè)各組外周血單個(gè)核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子RORc、Foxp3 mRNA水平。以β-actin作為內(nèi)參，RORc：上游5'-GTGCTGGTTAGGATGTGCCG-3'，下游5'-GTG GGAGAAGTCAAAGATGGA-3'；Foxp3上5'-AGAAGCA GCGGACACTCAATG-3'，下游 5'-GACTCAGGTTGTGGC GGATG-3'；β-actin ：上游 5'-TAGTTGCGTTACACCCTT TCTTG -3'，下游 5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT -3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為135bp、108bp和151bp，，所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3 觀察指標(biāo)和療效判定體征及REA評(píng)分參考《口腔扁平苔蘚（萎縮型、糜爛型）療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（試行）》［6］。REA評(píng)分：糜爛型者無糜爛病損0分，糜爛面低于1cm2者1分，糜爛面在1～3 cm2之間者2分，糜爛面在3 cm2以上者3分；充血萎縮者，無病損0分，充血萎縮面低于1cm2者1分，充血萎縮面在1～3 cm2之間者2分，充血萎縮面在3 cm2以上者3分；網(wǎng)紋病損者，無白色條紋0分，有條紋或丘疹1分。體征評(píng)分：無病損0分，輕微白色條紋1分，白色條紋伴隨充血或萎縮面＜1 cm2者2分，白色條紋合并充血或萎縮面＞1 cm2者3分，白色條紋伴隨糜爛面＜1 cm2者4分，白色條紋伴隨糜爛面 ＞1 cm2者5分。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，符合正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率“%”表示，組間比較采用四格表法χ2檢驗(yàn)。記P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血Th17、Treg細(xì)胞比較OLP患者外周血Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞水平均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但非糜爛型OLP的Th17/Treg比值與正常組無顯著差異（P＞0.05），見表1。

表1 各組外周血Th17/Treg比較［n（%）］

2.2 各組外周血IL-17、TGF-β1水平比較OLP患者外周血IL-17水平均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但TGF-β1組間兩兩比較無顯著差異（P＞0.05），見表2。

表2 各組外周血IL-17、TGF-β1水平比較

2.3 各組RORc mRNA、Foxp3mRNA相對(duì)表達(dá)量比較OLP患者RORc mRNA、Foxp3mRNA相對(duì)表達(dá)量高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但非糜爛型OLP 與正常組RORc mRNA/Foxp3mRNA比值組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

2.4 各組體征及RAE評(píng)分比較糜爛型OLP患者體征及RAE評(píng)分均高于非糜爛型OLP，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表3 各組RORc mRNA、Foxp3mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

表4 各組體征及RAE評(píng)分比較

2.5 RORc mRNA、Foxp3mRNA表達(dá)水平與體征及RAE評(píng)分的相關(guān)性Spearman相關(guān)性分析顯示，RORcmRNA與體征、RAE評(píng)分呈正相關(guān)（r=0.71，0.84，P＜0.05）RORc mRNA/Foxp3 mRNA也與體征、RAE評(píng)分均呈正相關(guān)（r=0.63，0.50，P＜0.05），且RORc mRNA與Foxp3mRNA呈正相關(guān)（r=0.58，P＜0.05），見表5。

表5 RORc、Foxp3mRNA表達(dá)水平與體征及RAE評(píng)分的相關(guān)性

3 討論

OLP是以T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主要表現(xiàn)的慢性炎癥反應(yīng)疾病，是口腔科常見口腔黏膜疾病，主要涉及峽部、舌、牙齦等部位病變［7］。OLP根據(jù)病損表現(xiàn)可分為多種表型，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者常將OLP分為糜爛型和非糜爛型，糜爛型OLP病損較非糜爛型更為嚴(yán)重，且隨病程遷延，會(huì)造成患者語言功能障礙甚至癌變［8］，對(duì)患者生存質(zhì)量和健康造成較大威脅。OLP目前病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與免疫、感染、遺傳等多種因素有關(guān)，而T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)在其中起到了重要作用。

Th17細(xì)胞是一種輔助性T淋巴細(xì)胞，可由初始CD4+T細(xì)胞分化而來。CD4+T細(xì)胞可在多種細(xì)胞因子作用下被病原體激活，分化為Th17和Treg細(xì)胞亞群，而Th17/Treg平衡對(duì)機(jī)體免疫狀態(tài)具有重要意義［9-10］。Th17細(xì)胞以分泌細(xì)胞因子IL-17為特征，具有促炎作用并與體內(nèi)多種免疫疾病有關(guān)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥等疾病患者體內(nèi)均檢出外周血Th17細(xì)胞數(shù)目的異常增加。田原野等人［11］研究發(fā)現(xiàn)，IL-17在OLP病損組織高度表達(dá)。本次研究中發(fā)現(xiàn)，糜爛型OLP患者外周血中IL-17水平明顯高于非糜爛型組和正常組，與上述研究報(bào)道一致。但孫倩倩等人［12］研究發(fā)現(xiàn)，分泌IL-17的T細(xì)胞亞群在OLP中有增高趨勢(shì)，但與正常對(duì)照組比較無顯著差異，因此認(rèn)為Th17細(xì)胞可能只參與了OLP致病過程。基于以上不同觀點(diǎn)，本次研究通過熒光定量PCR檢測(cè)了Th17特異性轉(zhuǎn)錄因子RORc的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)OLP患者RORc mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常組，表明Th17細(xì)胞同樣參與了OLP局部病理反應(yīng)過程。

Treg細(xì)胞在功能上與Th17細(xì)胞表現(xiàn)為拮抗作用，對(duì)自身免疫反應(yīng)及免疫疾病的發(fā)生具有抑制作用［13］。Treg細(xì)胞可分為天然型和外周誘導(dǎo)型兩種，主要通過表面抑制性分子作用于效應(yīng)T細(xì)胞，或分泌多種細(xì)胞因子如TGF-β1、IL-10等抑制效應(yīng)T細(xì)胞，NK殺傷細(xì)胞等的活化和增殖，因此自身免疫疾病患者普遍存在Treg細(xì)胞數(shù)目降低和（或）功能不全［14-16］。而其特異性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，在Treg細(xì)胞發(fā)育增殖及維持功能方面具有重要作用。Foxp3可結(jié)合RORc并抑制其功能作用，從而抑制IL-17的表達(dá)水平，從而發(fā)揮抗炎作用［17］。本次研究中發(fā)現(xiàn)，OLP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3表達(dá)水平上調(diào)，高于正常組，提示Treg細(xì)胞也參與了OLP炎癥反應(yīng)過程，并在其中起到免疫抑制作用。

單獨(dú)的Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞水平無法反映機(jī)體實(shí)際的免疫狀態(tài)，將兩者進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞數(shù)目呈正相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子RORc可協(xié)同其他轉(zhuǎn)錄因子參與Th17分化及功能調(diào)節(jié)，同時(shí)Treg細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如TGF-β1同樣參與了Th17細(xì)胞的分化過程［18］。推測(cè)Th17細(xì)胞可能起到Treg細(xì)胞的效應(yīng)T細(xì)胞作用，而Treg細(xì)胞數(shù)目的增加可能通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)來抑制IL-17水平升高從而起到抗炎作用［19］。本次研究還發(fā)現(xiàn)，糜爛型OLP患者體內(nèi)RORc/Foxp3比值高于非糜爛型OLP和正常組，提示Th17/Treg失衡參與了糜爛型OLP發(fā)病過程，但在非糜爛型OLP中變化不明顯。Spearman相關(guān)性分析顯示，RORcmRNA、RORc mRNA/Foxp3 mRNA 比值與體征和RAE評(píng)分呈正相關(guān)，推測(cè)Th17/Treg失衡可能通過加重炎癥反應(yīng)強(qiáng)度從而在OLP發(fā)病過程起到重要作用［20］。

OLP患者外周血中Th17和Treg細(xì)胞均處于高水平，但在非糜爛型OLP中Th17/Treg保持平衡，而在糜爛型OLP中存在以Th17為優(yōu)勢(shì)的Th17/Treg失衡，推測(cè)該失衡在OLP病損形成中起到了重要作用。