周建琴 祝宗英 孫婉悅 蔡佳鑫 才卓瑪 江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院

一、前言

（一）鉻的生物化學(xué)功能

許多研究表明，鉻的生物化學(xué)功能主要是作為胰島素的加強(qiáng)劑作用。Schwarz 和Mertz[1]首先觀察到鉻在糖代謝中的作用。從啤酒酵母中分離的生物活性鉻制劑和合成的生物活性鉻配合物，兩者都能降低糖尿病小鼠的血漿葡萄糖和甘油三酯[2]。

（二）富鉻酵母的研究意義

無(wú)機(jī)鉻形式不利于人體吸收，而有機(jī)鉻則能促進(jìn)對(duì)鉻的吸收。富鉻酵母是最普遍的一種補(bǔ)鉻形式。制備富鉻酵母的常用酵母菌種是啤酒酵母（又稱(chēng)釀酒酵母）[3]。啤酒酵母是一種安全可靠、它是不需要做毒性試驗(yàn)即可直接食用的少數(shù)幾種菌種之一；啤酒酵母是發(fā)酵工藝成熟，生產(chǎn)周期短，便于生產(chǎn)控制；啤酒酵母是目前作為微量元素載體最優(yōu)勢(shì)的菌種；此外，啤酒酵母還富含其它人體所必須的營(yíng)養(yǎng)素，用它來(lái)制備富鉻酵母，除具有補(bǔ)給鉻的功效外，還兼具補(bǔ)給氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用。因此，選用啤酒酵母作為鉻的補(bǔ)給載體意義顯著。富鉻酵母一般是通過(guò)在酵母培養(yǎng)基中加入無(wú)機(jī)鉻鹽（如KCr（SO4）2）的方法來(lái)制備的[4]：酵母在高濃度鉻環(huán)境中吸收并同化無(wú)機(jī)鉻化合物，之后轉(zhuǎn)化為有機(jī)鉻富集在酵母細(xì)胞中。

本研究涉及抗鉻離子較強(qiáng)的酵母菌株的篩選，以此為出發(fā)菌經(jīng)活化，抗性篩選擴(kuò)大培養(yǎng)，分析了在不同鉻濃度，培養(yǎng)時(shí)間，對(duì)鉻富集的影響以及抗鉻菌株最佳吸收條件及有機(jī)鉻含量和分布，為制備富鉻酵母和利用工業(yè)化廢酵母治理鉻污染奠定了基礎(chǔ)。

二、材料

（一）試劑

酵母提取物，葡萄糖，蛋白胨，麥芽，濃HNO3，HClO4，KCr（SO4）2。

（二）培養(yǎng)基

（1）YEPD 培養(yǎng)基：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，加蒸餾水至1L，加入20 克瓊脂，pH6.0，115℃濕熱滅菌15min，冷藏備用。

（2）麥芽汁培養(yǎng)基：取適量干麥芽，將其磨碎，一份麥芽加四份水，在65℃水浴鍋中糖化3～4h，糖化程度用碘法判斷之。將糖化液用4～6 層紗布過(guò)濾，濾液攪拌煮沸后再過(guò)濾。將濾液稀釋到5～6 波美度，pH 約6.4，加入2%瓊脂，115℃濕熱滅菌15min。

（三）主要儀器及設(shè)備

電子天平，單人雙面凈化工作臺(tái)，DNH-D 冷凍恒溫振蕩器皿，5804 離心機(jī)，血球記數(shù)板，研缽，顯微鏡，TAS-986 原子吸收分光光度計(jì)。

（四）酵母菌株

本實(shí)驗(yàn)中所用的10 株啤酒酵母株來(lái)源由江蘇食品藥品學(xué)院研究院和啤酒車(chē)間提供。

三、方法

（一）KCr（SO4）2 母液配制

稱(chēng)取50 克KCr（SO4）2水溶后，移至100mL 容量瓶中，定容至刻度，121℃滅菌15min，常溫下保存待用。

（二）鉻離子抗性酵母的篩選

（1）菌株的復(fù)蘇，活化

①將菌株原種接5ml 試管斜面活化一次（3 支，28℃，36-48h）

②從三支試管中選出一支生長(zhǎng)良好的接種至5ml 麥汁試管活化第二次（3 支，28℃48h）

③從三支麥汁試管中選出一支生長(zhǎng)良好的平板劃線（3 支，28℃，72h）

④挑選形態(tài)較好的單菌落，接種5ml 液體YEPD 培養(yǎng)基，震蕩培養(yǎng)36h，作為涂布平板的種子酵母

（2）不同種酵母耐金屬鉻篩選

制備鉻離子濃度分別為0.05mg/ml，0.10mg/ml，0.15 mg/ml，0.2 mg/ml，0.25mg/ml 的固體培養(yǎng)基50ml，待冷卻到50℃用微量可調(diào)移液器吸取100μl 麥芽汁培養(yǎng)基，滴入50ml 錐形瓶中，搖勻，澆注平板，28℃恒溫培養(yǎng)，48h 后觀察不同來(lái)源酵母菌株的培養(yǎng)情況，從中篩選鉻離子抗性較好的酵母菌株。

（3）鉻離子抗性菌株的馴化

將篩選到的抗性酵母菌株接入5ml 含鉻0.25mg/ml 的YEPD 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，放入恒溫調(diào)節(jié)搖瓶柜中馴化培養(yǎng)，溫度28℃，36h，澆注鉻離子濃度分別為0.05mg/ml，0.10mg/ml，0.15 mg/ml，0.20 mg/ml，0.25mg/ml 的平板，篩選抗性克隆。

（三）酵母的擴(kuò)大培養(yǎng)

活化后挑選生長(zhǎng)健壯、飽滿的單細(xì)胞菌落3～4 個(gè)分別接到試管斜面上培養(yǎng)（優(yōu)選3～4 個(gè)斜面，28℃培養(yǎng)48h）；選擇一個(gè)生長(zhǎng)良好的斜面接種到25 支麥芽汁試管中進(jìn)行28℃培養(yǎng)36～48h，生長(zhǎng)到細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml，按10%的接種量分別接入含KCr（SO4）2量 為0.05mg/ml，0.10mg/ml，0.15mg/ml，0.20 mg/ml，0.25mg/ml 的 麥 汁 培 養(yǎng) 基500ml 三角瓶5 到6 只，28℃震蕩培養(yǎng)96h。

表1 培養(yǎng)后鉻含量的分布狀況

（四）酵母細(xì)胞數(shù)的測(cè)定

在生長(zhǎng)到第12h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h 取樣，測(cè)定酵母的細(xì)胞數(shù)。無(wú)菌條件下各吸取1ml 發(fā)酵液，滴20μl 于細(xì)胞記數(shù)板上，在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)，每樣做5 次，取平均數(shù)M。然后根據(jù)公式：細(xì)胞濃度=M*50（個(gè)/ml）獲得發(fā)酵液中的細(xì)胞濃度。

（五）干酵母粉的制備

將發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液分裝到50 ml 的離心管，5000rmp 離心10 分鐘，收集沉淀，用100ml 蒸餾水5000rmp 離心10 分鐘，重復(fù)洗滌3 次。將酵母細(xì)胞沉淀放置在烘箱內(nèi)105℃，熱風(fēng)烘干7-8 小時(shí)，稱(chēng)重后在密閉玻璃瓶?jī)?nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

（六）發(fā)酵液中和酵母粉中鉻含量的測(cè)定

將發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液分裝到50 ml 的離心管，5000rmp 離心10min，取1mL 上清液測(cè)定其中的鉻含量。

稱(chēng)取1g 酵母粉用研缽研碎，100mL 燒杯中，加入20 mL 濃HNO3，10mLHClO4，在燒杯上蓋一個(gè)表面皿，在恒溫電板上加熱至120℃加熱1 小時(shí)，升溫到180℃加熱2小時(shí)，在加熱到200℃至冒白煙，消化液呈無(wú)色透明即可，冷卻，將消化液轉(zhuǎn)移至100或250mL 容量瓶中，并用蒸餾水多次洗滌燒杯，定容至刻度，即為富鉻酵母粉樣品溶液，原子吸收光譜法測(cè)定其中的鉻含量[5]。

四、結(jié)果

（一）不同來(lái)源酵母菌株對(duì)鉻離子抗性結(jié)果

不同來(lái)源酵母菌株在不同的鉻離子濃度的平板上培養(yǎng)，結(jié)果：鉻離子濃度在0.05mg/ml 和0.10umg/ml 時(shí)，10 株菌株都能生長(zhǎng)，單菌落生長(zhǎng)飽滿，且形態(tài)比較明顯。在鉻濃度為0.15mg/ml 時(shí)，除淮藥11 和食品2B，其余8 株受到鉻的抑制作用，菌體不能生長(zhǎng)。而鉻濃度為0.20mg/ml 時(shí)，除食品2B 能生長(zhǎng)外，其余9 株都不能生長(zhǎng)，當(dāng)鉻濃度為0.25mg/ml 時(shí)，10 株酵母菌株都不能正常生長(zhǎng)，結(jié)果說(shuō)明酵母菌株食品2B 具有較好的抗鉻離子能力，因此我們選食品2B 為出發(fā)菌，繼續(xù)研究。

（二）菌種馴化條件對(duì)酵母產(chǎn)量及富鉻能力的影響

將經(jīng)馴化的上2B 與未馴化的上2B 克隆分別接種培養(yǎng)，比較它們的酵母產(chǎn)量和富鉻的量，結(jié)果表明馴化后酵母產(chǎn)量為0.63g/500ml，未馴化的酵母產(chǎn)量為0.53g/500ml，增加不明顯，但是鉻離子的富集量明顯增加，未馴化的鉻富集量為158.1 ug/ml增加，馴化后增加為238.5 ug/ml。

（三）培養(yǎng)時(shí)間和不同鉻離子濃度對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響

將篩選到的酵母菌株上2B 鉻離子抗性克隆分別接種到濃度為0.20mg/ml 和0.25mg/ml 鉻離子的培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，跟蹤檢測(cè)酵母細(xì)胞數(shù)。結(jié)果表明發(fā)酵液中的酵母細(xì)胞數(shù)目隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，培養(yǎng)48h 后，發(fā)酵液中酵母細(xì)胞數(shù)由于絮凝作用急劇減少。酵母細(xì)胞數(shù)隨發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)而急劇增加，到48h 時(shí)達(dá)到為7×107個(gè)細(xì)胞/mL。當(dāng)鉻濃度達(dá)到0.25mg/ml 濃度時(shí)，酵母細(xì)胞數(shù)增長(zhǎng)明顯緩慢，到48h 時(shí)達(dá)到最高，約為4.0×107個(gè)細(xì)胞/mL，表明較高濃度的鉻離子對(duì)酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。

（四）干酵母產(chǎn)量測(cè)定

將發(fā)酵結(jié)束后的發(fā)酵液離心，取酵母，洗滌、干燥，稱(chēng)取干酵母的重量，結(jié)果：隨著培養(yǎng)基中鉻濃度的增加，由于鉻的抑制作用而酵母干重會(huì)有所下降。在鉻濃度為0.05mg/mL 時(shí)，每500mL 培養(yǎng)基中干酵母重最大，為1.25g。鉻濃度為0.10mg/mL時(shí)，酵母干重為1.02g，隨著鉻離子濃度的增加，酵母干重減小但是在濃度0.10mg/mL到0.20mg/mL 之間減小幅度不大，當(dāng)鉻離子濃度為0.25mg/ml 時(shí)，酵母干重小至0.41g，表明鉻離子濃度增加到一定濃度時(shí)會(huì)導(dǎo)致干酵母得率的下降很快。故綜合考慮鉻離子濃度對(duì)酵母的抗性和富集情況選擇培養(yǎng)酵母時(shí)添加鉻離子合適濃度為0.20mg/mL。

（五）發(fā)酵液中鉻的富集情況

分別對(duì)發(fā)酵液上清液，干酵母處理液以及酵母洗滌液樣品中的三價(jià)鉻離子進(jìn)行原子吸收光譜分析，結(jié)果如表1 所示。

從表1 中可以看出三價(jià)鉻的分布狀況，培養(yǎng)基中的鉻一部分存留在發(fā)酵上清液中，一部分被菌株酵母所吸收，轉(zhuǎn)化為有機(jī)鉻。另外一部分由于絮凝作用，離心后存在于沉淀物中。酵母細(xì)胞對(duì)鉻離子的吸收量隨培養(yǎng)基中鉻離子濃度的增加而增加，但是并是成比例，表明酵母細(xì)胞對(duì)重金屬離子的刺激具有緩沖作用，多數(shù)鉻離子隨著酵母的絮凝而沉淀，沉淀量隨鉻離子濃度增加而增加。

五、討論

我們通過(guò)鉻離子抗性的篩選，得到一株對(duì)鉻離子抗性較好的酵母菌株，并通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)得出了酵母細(xì)胞數(shù)，干酵母重，以及鉻在培養(yǎng)基，發(fā)酵上清液，酵母細(xì)胞等中的含量分布，最后通過(guò)原子吸收光譜對(duì)鉻離子進(jìn)行分析，結(jié)果表明培養(yǎng)基中的鉻離子最終會(huì)因酵母的吸收和酵母的絮凝而減少。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果酵母對(duì)鉻離子的最大吸收量為0.24mg/g，絮凝對(duì)鉻離子的最大沉淀量為0.26mg/g。這些數(shù)據(jù)為開(kāi)發(fā)富鉻酵母的健康應(yīng)用和處理環(huán)境中鉻污染問(wèn)題提供了重要的科學(xué)依據(jù)。