李 峰，鄧江麗，陳雯雯，余永紅，毛雅慧

(1.湖北工程學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 孝感 432000；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520)

野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestrispv.campestris，Xcc)又稱(chēng)甘藍(lán)黑腐病菌，屬于變形菌綱γ-亞綱黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)[1]，為革蘭氏陰性細(xì)菌。Xcc幾乎能侵染所有十字花科植物，引起黑腐病，該病害在全球廣泛分布，在中國(guó)各地均有發(fā)生，其中以甘藍(lán)、花椰菜[2]和蘿卜發(fā)病最為普遍。近年來(lái)，隨著中國(guó)菜田復(fù)種指數(shù)的普遍提高，細(xì)菌性黑腐病的發(fā)病程度和發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害中國(guó)十字花科蔬菜的生產(chǎn)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。Xcc侵染寄主植物是一個(gè)復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的多因子相互作用過(guò)程，在這一過(guò)程中，Xcc會(huì)產(chǎn)生多種致病因子，如毒素、菌黃素、胞外多糖和降解植物細(xì)胞的胞外酶等[5]。經(jīng)過(guò)多年的研究，人們對(duì)Xcc發(fā)病規(guī)律和致病機(jī)理雖有一定的了解，但是目前防治Xcc侵染的主要措施依然是化學(xué)防治和抗性品種利用?；瘜W(xué)防治帶來(lái)的農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染和食品安全等問(wèn)題嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。同時(shí)，由于病原菌在環(huán)境壓力下極易發(fā)生自發(fā)突變，使得抗性品種的推廣速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于病原菌變異的速度，造成抗性品種的應(yīng)用只是暫時(shí)和局部的。因此，為了滿(mǎn)足中國(guó)農(nóng)業(yè)可持續(xù)性發(fā)展，迫切需要研發(fā)綠色環(huán)保的新型防控藥劑與防治方法。

兒茶素(catechin)又稱(chēng)茶單寧、兒茶酚，是茶葉中黃烷醇類(lèi)物質(zhì)的總稱(chēng)，是茶葉多酚類(lèi)(tea polyphenols，TPs)物質(zhì)中的主要成分，約占茶多酚含量的75%～80%，也是茶葉苦澀味的重要來(lái)源之一[6]。茶多酚具有廣譜抗菌性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性菌均有抑制作用[7-8]。曹進(jìn)[9]通過(guò)研究?jī)翰杷貙?duì)引起齲齒的變異鏈球菌的影響，表明其對(duì)痢疾桿菌等致病菌都有不同程度的抑菌效果。此外，酯型兒茶素(ester type catechins，EGCG)不僅可以有效抑制齲齒致病菌的生長(zhǎng)繁殖甚至殺死致病菌，并且對(duì)牙周炎有良好的治療作用[10]。為了解決化學(xué)防腐劑在食品儲(chǔ)藏過(guò)程中存在的安全隱患問(wèn)題，兒茶素及其衍生物被廣泛用于食品防腐包裝中[11]，其主要對(duì)肉制品中常見(jiàn)的致病菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌[12]和沙門(mén)氏菌有抑制作用[13]；引起水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要細(xì)菌是假單胞類(lèi)腐敗菌，研究者發(fā)現(xiàn)茶多酚有利于海產(chǎn)品的保鮮，同時(shí)也不會(huì)對(duì)食品本身造成污染[14]。另外，茶多酚還可以抑制痢疾志賀氏菌、單增李斯特菌[15]和熒光假單胞菌[16]等多種細(xì)菌[17]。ZHANG等[18]用加工廢料生產(chǎn)出超細(xì)綠茶粉，鑒定了其化學(xué)成分，并探索了其對(duì)茄科勞爾氏菌(引起茄科植物青枯病)的抗菌潛力。然而，目前茶多酚的抑菌研究多集中在人畜病原菌及相關(guān)疾病的治療方面，關(guān)于其對(duì)植物致病菌抑制效果的研究甚少，尚未將其應(yīng)用到農(nóng)業(yè)病害防治領(lǐng)域。隨著人類(lèi)生活水平的不斷提高，對(duì)食品安全問(wèn)題也愈發(fā)重視，因此，不論將兒茶素開(kāi)發(fā)成為食品保鮮劑還是代替化學(xué)農(nóng)藥的天然抑菌劑，都具有環(huán)境友好、天然健康、對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害的優(yōu)點(diǎn)，并能極大滿(mǎn)足人們對(duì)物質(zhì)生活的追求，而兒茶素是否對(duì)植物病害具有良好防治效果，并最終成為農(nóng)藥替代品還需要更多的基礎(chǔ)研究提供理論支撐。

本研究是茶多酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)植物病原菌抑制作用的初探。研究確定從大葉紅茶中提取純化的兒茶素對(duì)野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的抑制效果，測(cè)定適宜質(zhì)量濃度下，兒茶素對(duì)Xcc致病因子(包括生物膜形成、胞外酶的分泌和運(yùn)動(dòng)性)的影響，并檢測(cè)兒茶素對(duì)蘿卜黑腐病的防治效果，旨在豐富兒茶素的抗菌譜，拓展其應(yīng)用領(lǐng)域，為人工合成與開(kāi)發(fā)新型環(huán)保藥劑提供化學(xué)模型，以期達(dá)到以綠色防控技術(shù)防治黑腐病的目的。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料

供試菌種：野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthomonas campestrispv.campestris，Xcc)Xcc-8004，保藏于湖北工程學(xué)院特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

供試植物：蘿卜(Raphanus sativusL.)，購(gòu)于當(dāng)?shù)夭耸袌?chǎng)。

1.1.2 培養(yǎng)基

NYG 培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5 g，酵母粉3 g，甘油20 g，瓊脂15.0 g，pH 7.0；胞外蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基：NYG 中含0.01 g/mL 的脫脂奶粉；胞外淀粉酶檢測(cè)培養(yǎng)基：NYG 中含0.001 g/mL 的可溶性淀粉；胞外纖維素酶檢測(cè)培養(yǎng)基：NYG 中含有0.005 g/mL 的羧甲基纖維素(CMC)；運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)培養(yǎng)基(swarming 平板)：NYG 中含0.5%瓊脂。

1.1.3 試驗(yàn)試劑

試驗(yàn)選用從大葉紅茶中提取的兒茶素，純度≥98%，由國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心惠贈(zèng)；100 μg/mL 利福平(Rif)用于培養(yǎng)野油菜黃單胞菌；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 兒茶素抑菌作用測(cè)定

利用濾紙片法檢測(cè)大葉兒茶素對(duì)Xcc8004 的抑菌效果。將兒茶素溶解于無(wú)菌水中，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，配制成質(zhì)量濃度為30 mg/mL的母液備用。準(zhǔn)備好Xcc菌懸液(約1×108CFU/mL)，用無(wú)菌棉簽蘸取菌液均勻涂布于NYG 固體平板上，將已滅菌并干燥好的直徑為5 mm 圓形濾紙片放置于涂布有菌液的培養(yǎng)基表面，再取兒茶素母液3 μL 滴加于濾紙片上，同時(shí)以無(wú)菌水做對(duì)照，將平板晾干后置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，觀察結(jié)果并記錄。試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.2.2 最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)和最低殺菌質(zhì)量濃度(MBC)的測(cè)定

接種Xcc于NYG 液體培養(yǎng)基中，28 ℃震蕩培養(yǎng)至平臺(tái)期(OD600為1.2)，再取10 μL 菌液接種至新鮮的NYG 液體培養(yǎng)基中，并加入不同質(zhì)量濃度的兒茶素溶液，使其終質(zhì)量濃度分別為：5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100 和110 μg/mL，以無(wú)菌水作陰性對(duì)照。28 ℃震蕩培養(yǎng)2 d 后，再分別將上述菌液進(jìn)行10 倍稀釋至10-8，取500 μL 滴加入到空培養(yǎng)皿中，再傾注適量約50 ℃溶解狀態(tài)的固體NYG培養(yǎng)基，輕輕搖勻使培養(yǎng)基和菌液混合均勻，靜置待培養(yǎng)基凝固，28 ℃培養(yǎng)2 d，分別計(jì)數(shù)平板中細(xì)菌總數(shù)，再換算為每1 mL 菌液中細(xì)菌數(shù)；MIC 即為兒茶素能夠抑制Xcc生長(zhǎng)的最低質(zhì)量濃度值，培養(yǎng)基上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低質(zhì)量濃度為其MBC。每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.2.3 生物膜形成能力檢測(cè)

用結(jié)晶紫染色法檢測(cè)兒茶素對(duì)Xcc生物膜形成的影響。接種Xcc于5 mL NYG 液體培養(yǎng)基中，28 ℃震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，離心收集菌體，用1 mL NYG 培養(yǎng)基重懸菌體，獲得1×106CFU/mL的菌懸液，將此菌懸液接種至裝有4 mL NYG 培養(yǎng)基的玻璃指形管中，并加入終質(zhì)量濃度為15 μg/mL 的兒茶素，無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，置于28 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5 d 后，倒掉培養(yǎng)液，無(wú)菌水洗管壁3 次，烘干后加入6 mL 1%的結(jié)晶紫染色30 min。倒掉染色液，用無(wú)菌水沖洗管壁，烘干指形管，觀察管壁上是否有1 圈紫色物質(zhì)，拍照記錄；用1 mL 無(wú)水乙醇溶解管壁結(jié)晶紫，測(cè)定630 nm 處吸收值并記錄。試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.2.4 胞外酶分泌能力的檢測(cè)

本研究采用平板檢測(cè)法分別檢測(cè)了兒茶素對(duì)Xcc分泌胞外蛋白酶、胞外淀粉酶及胞外纖維素酶能力的影響。

(1)胞外蛋白酶。接種Xcc于NYG 液體培養(yǎng)基中，28 ℃震蕩培養(yǎng)至平臺(tái)期，用移液器分別吸取2 μL 菌液接種于含0.01 g/mL 脫脂奶粉和終質(zhì)量濃度為15 μg/mL 的兒茶素的NYG 平板上，無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，靜止10 min。28 ℃培養(yǎng)2 d，通過(guò)比較菌落周?chē)馔该魅Φ挠袩o(wú)或大小判斷菌株產(chǎn)胞外蛋白酶的活性。試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

(2)胞外淀粉酶。接種Xcc于NYG 液體培養(yǎng)基中，28 ℃震蕩培養(yǎng)至平臺(tái)期，用移液器分別吸取2 μL 菌液接種于含0.001 g/mL 可溶性淀粉和終質(zhì)量濃度為15 μg/mL 的兒茶素的NYG 平板上，無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，靜止10 min。28 ℃培養(yǎng)2 d 后，用體積比為1∶100 的I2/KI (0.08 mol/L I2，3.2 mol/L KI)溶液染色10 min，然后用70%的酒精洗平板，能產(chǎn)生胞外淀粉酶的菌株其菌落生長(zhǎng)處及周?chē)尚纬蔁o(wú)色透明圈，觀察并測(cè)量透明圈的大小。試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

(3)胞外纖維素酶。接種Xcc于NYG 液體培養(yǎng)基中，28 ℃震蕩培養(yǎng)至平臺(tái)期，用移液器吸取2 μL 菌液接種于含有0.005 g/mL 的羧甲基纖維素(CMC)和終質(zhì)量濃度為15 μg/mL 的兒茶素的NYG 平板上，無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，靜置10 min。28 ℃培養(yǎng)2 d 后，在平板上加入約20 mL 0.1%的剛果紅染色30 min，水洗2 次，再用20 mL 1 mol/L 的NaCl 脫色2 次，每次約20 min，能產(chǎn)生纖維素酶的菌株其菌落生長(zhǎng)處及周?chē)纬梢煌该魅?，觀察并測(cè)量透明圈的大小。試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

試驗(yàn)中測(cè)得的透明圈的直徑大小代表不同胞外酶活性或產(chǎn)量的高低，由此來(lái)比較菌株在不同環(huán)境下所產(chǎn)胞外酶的差異。

1.2.5 運(yùn)動(dòng)性檢測(cè)

接種Xcc于NYG 液體培養(yǎng)基中，28 ℃震蕩培養(yǎng)至平臺(tái)期，用移液器吸取2 μL 菌液點(diǎn)接于含有0.5%瓊脂和終質(zhì)量濃度為15 μg/mL 的兒茶素的半固體培養(yǎng)基平板上(平板使用前在超凈臺(tái)晾5～10 min)，無(wú)菌水作為陰性對(duì)照，正置于超凈臺(tái)中待晾干，轉(zhuǎn)置28 ℃培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)2 d，觀察菌苔的擴(kuò)散情況并測(cè)量菌苔直徑。試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.2.6 兒茶素對(duì)蘿卜黑腐病的防治試驗(yàn)

試驗(yàn)參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行，具體步驟如下：接種Xcc于NYG 液體培養(yǎng)基中，28 ℃震蕩培養(yǎng)至平臺(tái)期備用；將新鮮白蘿卜先用自來(lái)水清洗干凈，晾干后再用75%的酒精涂抹在蘿卜表面進(jìn)行消毒，將蘿卜放置在超凈工作臺(tái)晾干，重復(fù)消毒3 次；再用消毒的刀具將蘿卜切成厚約5 mm 的薄片，分別放置在9 cm 無(wú)菌培養(yǎng)皿中。設(shè)置3 組試驗(yàn)，每組6 塊蘿卜切片，向其中2 組蘿卜切片上分別滴加100 μLXcc菌液，菌液會(huì)自動(dòng)擴(kuò)散，另一組為對(duì)照組不滴加菌液；稍微晾干后，將1 組滴加菌液的蘿卜片上涂抹100 μg/mL(MBC)的兒茶素溶液，另一組涂抹無(wú)菌水，對(duì)照組涂抹100 μg/mL 兒茶素溶液，放置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后再分別涂抹1 次兒茶素溶液或無(wú)菌水，12 h 后再重復(fù)1 次，總共培養(yǎng)時(shí)間為2 d，2 d 后取出觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兒茶素對(duì)Xcc 的抑菌活性分析

由圖1a 可知：在滴加有兒茶素的濾紙片周?chē)纬闪嗣黠@透明圈，而滴加有無(wú)菌水的對(duì)照組濾紙片周?chē)鸁o(wú)透明圈，說(shuō)明兒茶素能有效抑制Xcc的生長(zhǎng)。隨后采用濃度梯度稀釋法測(cè)定兒茶素對(duì)Xcc的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)及最低殺菌質(zhì)量濃度(MBC)，結(jié)果(圖1b)表明：兒茶素質(zhì)量濃度在20 μg/mL 時(shí)能夠顯著抑制Xcc的生長(zhǎng)(P＜0.05)；因此，兒茶素對(duì)Xcc的最低抑菌質(zhì)量濃度(MIC)為20 μg/mL。隨著兒茶素質(zhì)量濃度的升高，抑制活性越強(qiáng)，當(dāng)兒茶素質(zhì)量濃度達(dá)到100 μg/mL 時(shí)，能夠完全抑制Xcc的生長(zhǎng)，即最低殺菌質(zhì)量濃度(MBC)為100 μg/mL。在亞抑菌質(zhì)量濃度(5、10 和15 μg/mL)下，兒茶素均不能顯著抑制Xcc的生長(zhǎng)(P＞0.05)。

2.2 兒茶素對(duì)Xcc 生物被膜形成的影響

由圖2a 可知：在15 μg/mL 兒茶素作用下，指性管壁上幾乎沒(méi)有紫色圈的形成，而陰性對(duì)照組的管壁上有非常明顯的紫色圈。用無(wú)水乙醇溶解管壁結(jié)晶紫，比較試驗(yàn)組與對(duì)照組生物被膜的形成量，發(fā)現(xiàn)添加15 μg/mL 兒茶素情況下，Xcc形成生物被膜量?jī)H為對(duì)照組的16%左右(圖2b)，表明在亞抑菌質(zhì)量濃度下，兒茶素能夠極顯著抑制Xcc生物被膜的形成 (P＜0.001)。

圖1 兒茶素對(duì)Xcc 的抑菌活性檢測(cè)Fig.1 Detection of the antibacterial activity of catechin against Xcc

2.3 兒茶素對(duì)Xcc 分泌胞外酶的影響

研究結(jié)果顯示：添加15 μg/mL 兒茶素時(shí)，僅能夠極顯著抑制Xcc的蛋白酶的分泌(圖3)，此時(shí)Xcc所產(chǎn)胞外蛋白酶的量?jī)H為對(duì)照組的18%，而對(duì)淀粉酶(圖4)和纖維素酶(圖5)的分泌均無(wú)影響。

2.4 兒茶素對(duì)Xcc 運(yùn)動(dòng)性的影響

由圖6 可知：在15 μg/mL 兒茶素作用后，Xcc運(yùn)動(dòng)能力減弱，與對(duì)照組相比，運(yùn)動(dòng)直徑從1.2 cm 降至0.8 cm，為對(duì)照組的73%，表明兒茶素對(duì)Xcc的運(yùn)動(dòng)性有極顯著的抑制效果。

2.5 兒茶素對(duì)蘿卜黑腐病的防治效果檢測(cè)

接種黑腐病病原菌Xcc8 004 后，未使用兒茶素、僅添加無(wú)菌水的對(duì)照組的蘿卜切片從心部開(kāi)始發(fā)生腐爛，病害嚴(yán)重(圖7a)；涂抹了質(zhì)量濃度為100 μg/mL 兒茶素的蘿卜切片僅有輕微腐黑(圖7b)；在添加了兒茶素不接種病原菌的自然條件下，蘿卜切片保存完好，未感染黑腐病(圖7c)。以上結(jié)果表明兒茶素對(duì)Xcc具有較強(qiáng)的抑制作用，能有效防治蘿卜黑腐病的發(fā)生。

圖2 兒茶素對(duì)Xcc 生物被膜形成的影響Fig.2 Effect of catechin on Xcc biofilm formation

圖3 兒茶素對(duì)Xcc 分泌胞外蛋白酶的影響Fig.3 Effect of catechin on extracellular protease secreted by Xcc

圖4 兒茶素對(duì)Xcc 分泌胞外淀粉酶的影響Fig.4 Effect of catechin on extracellular amylase secreted by Xcc

圖5 兒茶素對(duì)Xcc 分泌胞外纖維素酶的影響Fig.5 Effect of catechin on extracellular cellulase secreted by Xcc

3 討論

圖6 兒茶素對(duì)Xcc 運(yùn)動(dòng)性的影響Fig.6 Effect of catechin on Xcc motility

國(guó)內(nèi)外針對(duì)野油菜黃單胞菌野油菜致病變種的致病機(jī)理的研究較多，如對(duì)其毒力基因功能進(jìn)行深入研究，揭示這些基因在致病性中的作用等，但是目前仍未找到有效的黑腐病治療方法與藥劑?，F(xiàn)有的防控措施如化學(xué)防治使用的是傳統(tǒng)農(nóng)藥及抗生素類(lèi)，存在環(huán)境污染和引起病菌抗性等諸多隱患，抑制該病原菌的天然抑菌劑還未見(jiàn)報(bào)道，尚未被開(kāi)發(fā)。有研究報(bào)道殼聚糖能抑制黃單胞菌屬細(xì)菌[20-21]，但殼聚糖的抑菌作用是否具有種屬特異性，以及它對(duì)Xcc是否有顯著抑制效果均暫未得到研究證實(shí)。生防菌的開(kāi)發(fā)應(yīng)用已成為當(dāng)下植物保護(hù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，它是一種植物病害生物防治的綠色藥劑，具有良好的環(huán)境兼容性、抗性發(fā)生頻率低、安全性良好和來(lái)源豐富等特點(diǎn)，但生防菌需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的篩選過(guò)程，其應(yīng)用效果也需進(jìn)行評(píng)定，導(dǎo)致開(kāi)發(fā)周期長(zhǎng)，且從已搜集的文獻(xiàn)看，目前拮抗Xcc的生防菌暫未被開(kāi)發(fā)。另外，生防菌如果能與相關(guān)植物源抑菌劑復(fù)配使用，則能較好保證病害的防治效果。因此，針對(duì)黑腐病病原菌Xcc的植物源抑菌劑的開(kāi)發(fā)十分必要。

圖7 兒茶素對(duì)蘿卜黑腐病的防治效果Fig.7 The control effect of catechin against black rot disease on radish

細(xì)菌生物膜是一個(gè)重要的致病因子，在植物—病原物互作中具有毒性作用，因此對(duì)生物膜形成的測(cè)定十分必要，本研究已證明兒茶素能有效抑制Xcc生物膜的形成。兒茶素對(duì)Xcc運(yùn)動(dòng)能力的抑制，能減弱病原菌在宿主植物內(nèi)的定殖能力。本研究已證明兒茶素能引起Xcc胞外蛋白酶產(chǎn)量的降低，病原菌正是通過(guò)分泌的胞外酶來(lái)降解植物細(xì)胞壁，從而使其順利入侵植物體內(nèi)。研究結(jié)果均表明：在兒茶素的作用下，病原菌的毒力在一定程度上被抑制，這為兒茶素開(kāi)發(fā)成為黑腐病防控藥劑提供了理論依據(jù)。本研究已經(jīng)證明兒茶素能抑制Xcc8004 產(chǎn)生的相關(guān)致病因子，但具體作用機(jī)制尚不清楚，兒茶素等茶葉中多酚類(lèi)化合物對(duì)Xcc的抑制作用機(jī)理還有待從分子層面進(jìn)行研究。從已有研究總結(jié)的兒茶素主要抑菌機(jī)理包括：對(duì)微生物細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和酶以及金屬離子的影響[22]。在病原菌與寄主植物的互作過(guò)程中，細(xì)菌的蛋白分泌系統(tǒng)起著非常重要的作用，其中Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system，TTSS)是病原細(xì)菌致病所依賴(lài)的最重要的分泌系統(tǒng)[23]。Ⅲ型分泌系統(tǒng)在植物和動(dòng)物病原菌中高度保守，而且對(duì)Xanthomonas的致病性非常重要，Xcc通過(guò)Ⅲ型分泌系統(tǒng)將效應(yīng)蛋白分泌到植物體內(nèi)，從而完成Xcc在植物體內(nèi)的侵染過(guò)程[24]。后期課題組將搜集Xcc中可能的效應(yīng)蛋白，并通過(guò)構(gòu)建相應(yīng)基因的缺失菌株，在兒茶素作用下檢測(cè)這些基因缺失突變株的生長(zhǎng)情況，從而尋找出兒茶素作用的靶基因。在運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)中，由于兒茶素為15 μg/mL 的亞抑菌質(zhì)量濃度，在此條件下兒茶素對(duì)Xcc8004 的生長(zhǎng)有一定抑制作用，因此細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性降低也可能是因?yàn)榧?xì)菌生長(zhǎng)受限導(dǎo)致菌落直徑變小，對(duì)于“兒茶素使細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性降低”的結(jié)論還需提供更多佐證，后期將在添加兒茶素情況下對(duì)Xcc進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，重點(diǎn)關(guān)注運(yùn)動(dòng)性相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平，或通過(guò)掃描電鏡觀察細(xì)菌鞭毛的形成情況，進(jìn)一步驗(yàn)證兒茶素對(duì)運(yùn)動(dòng)性的影響效果。

細(xì)菌對(duì)多酚的耐受力取決于細(xì)菌的種類(lèi)和多酚的結(jié)構(gòu)，因此，從不同茶葉品種中提取出的茶多酚的抑菌效果是否存在差異同樣值得關(guān)注。然而由于兒茶素的提取工藝復(fù)雜以及成本頗高，將其應(yīng)用于大田試驗(yàn)或進(jìn)行大面積噴施的措施并非科學(xué)合理的方案，可考慮人工合成其衍生物，本研究可供實(shí)踐應(yīng)用參考。

4 結(jié)論

從大葉紅茶中提取純化的兒茶素對(duì)野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xcc)具有一定的抑制作用，兒茶素對(duì)Xcc抑制的MIC 值為20 μg/mL，MBC 值為100 μg/mL。在兒茶素亞抑菌質(zhì)量濃度(15 μg/mL)條件下，其對(duì)Xcc的生物膜形成、胞外蛋白酶分泌和運(yùn)動(dòng)性均有極顯著抑制作用(P＜0.001)，但對(duì)Xcc產(chǎn)生的胞外纖維素酶和胞外淀粉酶沒(méi)有影響。在活體檢測(cè)試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)兒茶素對(duì)白蘿卜黑腐病的發(fā)生具有良好的防治作用。本研究可為十字花科黑腐病的防治提供天然殺菌劑模型與理論依據(jù)。