孫莉萍，焦黎明，楊政楠，潘心，夏然，陳磊山

(1.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)學(xué)院藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

巴豆苷(Crotonoside)又稱異鳥苷(CAS號1818-71-9)，是一種天然的核苷類化合物，最早從中藥巴豆種子中分離得到。巴豆苷是巴豆重要的活性成分[1]。研究顯示，巴豆苷具有多種生理活性，如能夠增進(jìn)腸道蠕動、降低血壓，能夠刺激大腦使AMP(腺苷酸)富集[2]，對小鼠S180腹水瘤和Ehrlich實(shí)體腫瘤都有顯著的抑制作用[3]，可通過抑制FLT3和HDAC3/6在急性髓性白血病(AML)細(xì)胞中表現(xiàn)出選擇性的后抑制作用[4]，可以通過調(diào)節(jié)兔心室肌細(xì)胞鈉鈣通道而具有抗心律失常作用[5]。另外，巴豆苷是生物體內(nèi)RNA的結(jié)構(gòu)片段鳥苷的異構(gòu)體，可以作為鳥苷的類似物嵌入RNA片段中并進(jìn)行基因表達(dá)，從而在生化研究中具有重要用途[6]。

目前，巴豆苷除了從天然資源中分離得到以外，化學(xué)合成法主要有以下3種路線：1)2-取代(I、Cl或NH2)腺苷經(jīng)過光照水解[7]或重氮化反應(yīng)[8]得到，但是選擇性差，收率很低，或者2-羥基-6-硫取代嘌呤核苷經(jīng)氨解得到[9]，但是原料合成難度大(圖1，路線1)；2)異鳥嘌呤經(jīng)硅醚保護(hù)后和基團(tuán)保護(hù)的核糖在TMSOTf或SnCl4催化下縮合，再脫除保護(hù)基得到，缺點(diǎn)是步驟多，收率低，異鳥嘌呤的合成難度也很大[10](圖1，路線2)；3)氨基咪唑甲酰胺核苷經(jīng)環(huán)合仿生合成異鳥苷，但收率很低，不具有合成上的價值[11](圖1，路線3)。以上3種反應(yīng)路線限制了巴豆苷合成規(guī)模的擴(kuò)大。從廉價易得的原料合成得到巴豆苷，可以避免從天然產(chǎn)物中分離、提取的繁瑣步驟，擴(kuò)大巴豆苷的來源；也可以解決現(xiàn)有化學(xué)合成方法中存在的收率低等問題。

圖1 巴豆苷合成路線比較

鳥苷是核苷化學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)原料，可以通過發(fā)酵法規(guī)?；a(chǎn)，價格低[12]。筆者以鳥苷原料，經(jīng)過乙酰化、氯代、重氮化、氨解同時脫除乙酰基等4步，得到巴豆苷，總收率62%。合成路線見圖2。

圖2 巴豆苷的合成路線

1 實(shí)驗部分

1.1 原料與儀器

鳥苷，分析純，新鄉(xiāng)拓新藥業(yè)股份有限公司；其他所用試劑均為市售分析純。

XT4型顯微熔點(diǎn)測定儀，溫度計未校正，北京科儀電光儀器廠；AV 400型核磁共振儀(DMSO-d6或CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)，德國Bruker公司。

1.2 合成方法

1.2.1 2′，3′，5′-三-O-乙?；B苷(3)

鳥苷(2，2.83 g，10 mmol)加入到乙腈(100 mL)中，再加入DMAP(N，N-二甲基吡啶，0.18 g，0.5 mmol)和三乙胺(6.23 mL，45 mmol)，攪拌30 min，冰水冷卻，5 ℃下滴加醋酸酐(3.4 mL，36 mmol)，滴加完畢，轉(zhuǎn)移至油浴鍋，緩慢升溫至60 ℃，持續(xù)反應(yīng)2 h，TLC顯示原料反應(yīng)完全，加入甲醇(5 mL)，再繼續(xù)反應(yīng)30 min，冷卻至室溫，減壓濃縮，有固體析出，過濾，水重結(jié)晶，得到白色固體0.388 g，收率95%。

白色固體，m.p. 231～233 ℃(文獻(xiàn)[13]m.p. 231～233 ℃)。1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz) δ 10.73(s, 1H), 7.94(s, 1H), 6.54(brs, 2H), 6.00(d,J=6.0 Hz, 1H), 5.80(t,J=5.6 Hz, 1H), 5.03(t,J=5.6 Hz, 1H), 4.40～4.24(m, 3H), 2.12(s, 3H), 2.05(s, 3H), 2.04(s, 3H);13C NMR(DMSO-d6, 100 MHz) δ 170.6, 169.96, 169.7, 157.1, 154.4, 151.6, 136.1, 117.3, 84.9, 80.0, 72.5, 70.8, 63.6, 21.0, 20.9, 20.7。

1.2.2 6-氯-2′，3′，5′-三-O-乙酰基鳥苷(4)

2′，3′，5′-三-O-乙?；B苷(3，0.409 g，1 mmol)和N，N-二甲基苯胺(0.128 mL，1 mmol)溶于乙腈(10 mL)，室溫攪拌30 min，加入氯化芐基三乙銨(0.332 g，2 mmol)，繼續(xù)攪拌10 min，滴加POCl3(0.548 mL，6 mmol)，升溫至回流，持續(xù)反應(yīng)2 h，TLC顯示原料反應(yīng)完全，冷卻至室溫，倒入冰水中，攪拌，用CH2Cl2(10 mL×3)萃取，有機(jī)相用飽和NaHCO3溶液(10 mL)洗滌，活性炭脫色和無水Na2SO4干燥，過濾、減壓濃縮后加入異丙醇(5 mL)，加熱溶解，靜置2 h，有固體析出，過濾，濾餅干燥后即得白色固體0.371 g，收率87%。

白色固體，m.p. 151～153 ℃(文獻(xiàn)[13]m.p. 151～153 ℃)。1H NMR(CDCl3, 400 MHz) δ 7.88(s, 1H), 6.02～5.95(m, 2H), 5.75(d,J=4.4 Hz, 1H), 5.30(brs, 2H), 4.47～4.35(m, 3H), 2.15(s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.09(s, 3H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz) δ 170.5, 169.6, 169.4, 159.1, 153.1, 151.9, 140.7, 125.8, 86.6, 80.0, 72.7, 70.5, 62.9, 20.7, 20.6, 20.4。

1.2.3 2-羥基6-氯-9-(2′，3′，5′-三-O-乙?；?-β-D-呋喃核糖基嘌呤(5)

將4(0.428 g，1 mmol)加入到CHCl3(9 mL)中，攪拌溶解，加入H2O(1 mL)，室溫滴加亞硝酸異戊酯(0.403 mL，3 mmol)，升溫到60 ℃，繼續(xù)反應(yīng)2 h，TLC顯示反應(yīng)完全，減壓濃縮，柱層析分離[流動相V(氯仿)∶V(甲醇)=9∶1]，得到白色固體0.346 g，收率81%。

白色固體，m.p. 132～133 ℃(文獻(xiàn)[14]m.p. 131～133℃)。1H NMR(CDCl3, 400 MHz) δ 10.80(s, 1H), 7.95(s, 1H), 6.18(d,J=5.6 Hz, 1H), 5.92(t,J=5.6 Hz, 1H), 5.66(t,J=4.8 Hz, 1H), 4.45～4.33(m, 3H), 2.12(s, 3H), 2.09(s, 3H), 2.06(s, 3H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz) δ 170.3, 169.6, 169.4, 155.6, 153.0, 149.7, 138.9, 120.1, 86.3, 80.3, 73.2, 70.7, 63.1, 20.7, 20.5, 20.4。

1.2.4 巴豆苷(1)

將5(0.428 g，1 mmol)和飽和的NH3/CH3OH溶液(10 mL)加入到密封反應(yīng)管中，加熱到50 ℃反應(yīng)12 h，冷至室溫，釋放壓力，反應(yīng)液真空濃縮，水重結(jié)晶，得到白色固體10.263 g，收率93%。

白色固體，m.p. 238～240 ℃(文獻(xiàn)[15]m.p. 238～240 ℃)。1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz) δ 10.88(s, 1H), 8.37(s, 1H), 7.83(brs, 2H), 5.81(d,J=6.0 Hz, 1H), 5.47(d,J=6.0 Hz, 1H), 5.19(d,J=4.8 Hz, 1H), 5.05(t,J=4.8 Hz, 1H), 4.52～4.48(m, 1H), 4.12～4.09(m, 1H), 3.93 (d,J=3.6 Hz, 1H), 3.67～3.52 (m, 2H);13C NMR(DMSO-d6, 100 MHz) δ 160.2, 156.0, 151.6, 137.1, 112.4, 84.1, 83.3, 75.6, 61.1。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成路線優(yōu)化

合成得到中間體4之后，除了圖2所示的路線，理論上也可以先氨解得到2-氨基腺苷(6)，然后發(fā)生重氮化反應(yīng)。但是，這條路線的收率只有32%，并且重氮化反應(yīng)選擇性差，還會有鳥苷(2)等副產(chǎn)物的產(chǎn)生。

2.1.1 2-氨基腺苷(6)合成

將化合物4(0.428 g，1 mmol)和飽和的NH3/CH3OH溶液(50 mL)加入到密封反應(yīng)管中，加熱到50 ℃反應(yīng)12 h，冷至室溫，釋放壓力，反應(yīng)液真空濃縮，水重結(jié)晶，得到白色固體60.239 g，收率85%。

白色固體，m.p. 235～237 ℃(文獻(xiàn)[15]m.p. 235～237 ℃)。1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7.93 (s, 1H), 6.79 (brs, 2H), 5.74 (brs, 2H), 5.73 (s, 1H), 5.45 (t,J=4.8 Hz, 1H), 5.37 (d,J=6.4 Hz, 1H), 5.10 (d,J=4.4 Hz, 1H), 4.55 (q,J=6.0 Hz, 1H), 4.13 (q,J=4.0 Hz, 1H), 3.93 (d,J=2.8 Hz, 1H), 3.68～3.64 (m, 1H), 3.58～3.52 (m, 1H);13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ 160.5, 156.7, 151.9, 136.8, 114.1, 87.6, 86.0, 73.7, 71.2, 62.2。

2.1.2 重氮化法合成巴豆苷(1)

化合物6(0.282 g，1 mmol)加入到H2O(10 mL)中，再加入NaNO2(0.24 g，3.5 mmol)，攪拌溶解，滴加AcOH(0.27 mL，6.9 mmol)，升溫到50 ℃反應(yīng)1 h，反應(yīng)完畢，降至室溫，用氫氧化鈉溶液中和，減壓濃縮，水重結(jié)晶，得到的固體柱層析分離，得到巴豆苷和鳥苷，收率分別為32%和21%。

鳥苷(2)：白色固體，m.p. 238～240 ℃(文獻(xiàn)[16]m.p. 238～240 ℃)。1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 10.65 (s, 1H), 7.94 (brs, 1H), 6.45 (brs, 2H), 5.71 (d,J=6.4 Hz, 1H), 5.39 (d,J=6.0 Hz, 1H), 5.11 (d,J=4.8 Hz, 1H), 5.03 (t,J=5.2 Hz, 1H), 4.43 (q,J=5.6 Hz, 1H), 4.11 (q,J=4.4 Hz, 1H), 3.90 (q,J=4.4 Hz, 1H), 3.65-3.60 (m, 1H), 3.56～3.51 (m, 1H);13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ 157.2, 154.1, 151.8, 136.1, 117.2, 86.8, 85.7, 74.2, 70.8, 61.9。

2.2 2-羥基9-(2′，3′，5′-三-O-乙酰基)-β-D-呋喃核糖基嘌呤(5)合成條件優(yōu)化

嘌呤環(huán)外氨基參與重氮化活性較低，其重氮化反應(yīng)直接影響2位羥基的引入，是整條合成路線的關(guān)鍵步驟。對重氮化反應(yīng)的關(guān)鍵條件重氮化試劑、溶劑、反應(yīng)溫度等進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，以水溶劑，以NaNO2/醋酸為重氮化試劑，在室溫條件下反應(yīng)4 h，無反應(yīng)發(fā)生。提高溫度至50 ℃，收率17%。溶劑中加入吡啶或氯仿作為混合溶劑，收率稍有提高，分別達(dá)到20%和33%。隨后，對重氮化試劑進(jìn)行了篩選。亞硝酸叔丁酯收率高于NaNO2/醋酸，6 mmol的亞硝酸叔丁酯可以得到60%的收率。當(dāng)把亞硝酸叔丁酯改變?yōu)閬喯跛岙愇祯r，收率提高到68%。隨著溫度的升高，收率提高，60 ℃時收率基本不再增加，達(dá)到72%。延長反應(yīng)時間至6 h，收率78%。綜上，合成6的優(yōu)化條件為：6 mmol亞硝酸異戊酯，CHCl3/H2O為混合溶劑，60 ℃反應(yīng)6 h，收率81%。

表1 2-羥基6-氯-9-(2′，3′，5′-三-O-乙?；?-β-D-呋喃核糖基嘌呤(5)合成條件優(yōu)化

2.3 關(guān)鍵反應(yīng)步驟反應(yīng)規(guī)模對反應(yīng)的影響

為了增加該反應(yīng)的實(shí)用性，考察了關(guān)鍵步驟氨解和重氮化的反應(yīng)規(guī)模對收率的影響(表2)。結(jié)果顯示，在適當(dāng)延長反應(yīng)時間后，氨解步驟可以擴(kuò)大到200 g，重氮化步驟可以擴(kuò)大到100 g，收率沒有下降，分離純化不需柱層析，操作及后處理均非常簡便。

表2 不同反應(yīng)規(guī)模對收率的影響

由表2可知，在反應(yīng)規(guī)模達(dá)到200 g時，經(jīng)過常規(guī)的分離提純后，氨解收率可以達(dá)到88%。在反應(yīng)規(guī)模達(dá)到100 g時，重氮化步驟的收率可以達(dá)到78%。對母液回收利用，收率還會有所增加，所以，總體上整條路線的收率高，分離純化簡便，具有一定的應(yīng)用性。但是重氮化步驟盡管沒有中間產(chǎn)物重氮類化合物的分離，降低了爆炸性危險系數(shù)，但是在反應(yīng)規(guī)模擴(kuò)大以后仍然具有一定的危險，這也是本方法的局限性所在。

3 結(jié) 論

以鳥苷為原料，用乙酰基保護(hù)糖環(huán)上的羥基，再和POCl3反應(yīng)，將6位羰基轉(zhuǎn)化為氯原子，繼而在亞硝酸異戊酯作用下發(fā)生重氮化反應(yīng)，將2位氨基轉(zhuǎn)化為羥基，最后在飽和的NH3/CH3OH溶液中將6位氯原子氨解轉(zhuǎn)化為氨基，同時脫除乙?；?，以4步和62%的總收率得到巴豆苷。該方法原料廉價易得，解決了傳統(tǒng)方法中原料價格高的問題，產(chǎn)物成本低，高效、簡便，易于擴(kuò)大生產(chǎn)，反應(yīng)規(guī)?？梢詳U(kuò)大到200 g，收率基本沒有降低，具有一定的應(yīng)用前景。