張珺,周瑞佳,趙升,李繼業(yè),姚海燕,徐東會,韓龍江

(1.國家海洋局北海標準計量中心 青島 266033;2.國家海洋局北海環(huán)境監(jiān)測中心 青島 266033;3.國家海洋局溢油鑒別與損害評估技術重點實驗室 青島 266033)

黃海海域自2008年至今已連續(xù)暴發(fā)了多次主要由石莼屬(Ulva)大型海洋綠藻類漂浮聚集引發(fā)的綠潮(green tides)災害,對近海海洋生態(tài)系統(tǒng)健康和海洋經濟發(fā)展產生了重大影響,如不采取有效的防控措施,黃海綠潮災害的發(fā)生將呈現(xiàn)常態(tài)化趨勢[1]?，F(xiàn)階段,對于滸苔生理學的研究多集中于外界環(huán)境變化對于藻體自身的影響方面[2-3],而并未從其機制方面對造成這些變化的原因進行深入剖析。本研究已經對黃海漂浮綠藻種類組成及時空分布做了相關的研究分析,猜測黃海漂浮綠藻種群演替與時空分布的變化可能是由于不同地區(qū)的溫度、鹽度及光照的差異造成的,然而影響綠潮暴發(fā)的因素多種多樣,因此,對于綠藻的培養(yǎng)條件下,溫度、鹽度及光照對滸苔的生理生態(tài)特征也應進行相關的論證。

本研究將使用葉綠素熒光測定儀Phyto-pam(德國walz),利用葉綠素熒光的變化反映環(huán)境因子對藻類光合作用的影響[4]。通過葉綠素熒光參數(shù)分析,反映PSⅡ量子產量[5],一般情況下,植物潛在的最大光化學量子產量(F v/F m)是一個很穩(wěn)定的值,反映PSⅡ最大的光能轉化效率。有學者認為綠藻的F v/F m 介于0.7～0.75 時,其生理狀態(tài)較為正常[6],因此該參數(shù)可以作為表征植物體生長狀態(tài)的一個重要物理量。

1 材料與試劑

1.1 材料準備

培養(yǎng)試驗所用的滸苔樣品為2018年5—8月取自黃海斷面調查樣品,經培養(yǎng)試驗后,滸苔樣品在北海環(huán)境監(jiān)測中心生態(tài)效應模擬實驗室藻類培養(yǎng)室中進行了保種處理。

1.2 主要儀器與試劑

培養(yǎng)實驗所需儀器等物品為北海環(huán)境監(jiān)測中心生態(tài)效應模擬實驗室藻類培養(yǎng)室提供。另外,實驗室內分析儀器如葉綠素熒光測定儀Phyto-pam(德國walz)等也是由北海環(huán)境監(jiān)測中心分子生物學實驗室提供。

首先稱取每個站位的底泥樣品濕重20 g,放于500 m L滅菌的燒杯中,加入滅菌海水400 m L,用玻璃棒充分攪拌,靜置15～20 min。然后將燒杯上部較澄清的泥漿轉移到另一個滅菌的燒杯中,丟棄掉沉入底部的較大石粒和沙粒。用滅菌的海水補齊500 m L,再次充分攪拌后,將250 m L的培養(yǎng)液轉移到另一個已滅菌的燒杯中,隨后的培養(yǎng)方法參考海水樣品的培養(yǎng)。通過統(tǒng)計培養(yǎng)出的幼苗數(shù)量,可以確定20 g泥樣中的綠藻顯微繁殖體數(shù)量。

2 實驗方法

綠藻生長過程中,環(huán)境中海水鹽度、營養(yǎng)成分的變化對其生長有著重要的影響。為研究不同營養(yǎng)條件(尤其是重要的營養(yǎng)成分氮和磷的濃度)、鹽度、溫度及光照對綠藻生長的影響,對將實驗室內培養(yǎng)的滸苔置于不同溫度、不同鹽度及不同光照強度條件下培養(yǎng),每個梯度實驗設置3個平行樣,實驗采用光照培養(yǎng)箱進行培養(yǎng),光照周期設為12 h∶12 h,采用葉綠素熒光測定儀Phyto-pam 檢測藻體光合參數(shù)。

鹽度梯度為0‰、10‰、20‰、30‰、40‰。

溫度 梯 度 為5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃。

光照梯度為40μmol/(m2·s)、80μmol/(m2·s)、160μmol/(m2·s)、400μmol/(m2·s)。

實驗周期為20周,每隔5天換一次水,3天添加一次營養(yǎng)鹽并觀察生長狀況。

3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差(One-Way ANOVA)分析,比較實驗結果差異顯著性,結果以平均值±標準差(SD)表示。多重比較采用Dunnett's方法。

4 結果

4.1 鹽度對綠藻生長生理特征影響的研究

在室內不同環(huán)境條件下培養(yǎng)2～3天后,藻體的光合放氧速率在鹽度為0‰下顯著降低,比其他鹽度下的要低了59%～64%,其他各鹽度間(10‰～40‰)以及與初始值(圖1虛線)間則都無明顯差異;培養(yǎng)8天后,鹽度為0‰下,滸苔藻體的光合放氧速率降為負值,其他各鹽度間則沒有顯著差異(圖1)。

圖1 鹽度對滸苔光合生理特征影響

不同鹽度條件下,對滸苔葉綠素熒光參數(shù)測定結果表明,在鹽度為0‰的條件下,滸苔F v/F m 快速降低,在處理第一天便下降了50%以上,隨后F v/F m 維持在較低水平,脅迫處理6天后,F v/F m無法測定。鹽度在10‰～40‰時,在前5天各處理樣品F v/F m 沒有明顯變化,均維持在0.5～0.6,之后樣品F v/F m 有不同程度的降低,其中鹽度為30‰時,處理樣品F v/F m 降低較為明顯。

圖2 不同鹽度條件下,滸苔F v/F m 變化

4.2 溫度對綠藻生長生理特征影響的研究

對滸苔樣本的室內實驗顯示,35℃下培養(yǎng)的藻體幾乎全變白,只有部分藻體為淡綠色,光合放氧速率也迅速降為負值,而其他不同溫度(5℃～30℃)條件下,則都未發(fā)生顯著變化(圖3)。

不同實驗溫度條件下,對滸苔葉綠素熒光參數(shù)測定結果表明,在5℃～25℃,樣品實際量子效率F v/F m 隨溫度的上升而逐步升高,之后隨著溫度的進一步升高而快速降低。

圖3 溫度對滸苔光合生理特征影響

對材料進行連續(xù)培養(yǎng)并測定F v/F m 的結果可知,在5℃、10℃、15℃下,滸苔樣品F v/F m 在處理第一天便明顯降低,隨后幾天穩(wěn)定在0.4～0.5。在20℃和25℃下,樣品F v/F m 在6天的培養(yǎng)時間未發(fā)生明顯變化,均維持在0.6左右。30℃處理樣品F v/F m 在處理第一天有所降低,但隨后逐步恢復到0.6左右。35℃處理樣品F v/F m 明顯受到溫度的影響,在處理第一天后便下降30%以上,之后隨處理時間的延長而進一步降低,在處理6天后F v/F m處于一定范圍的波動(圖4)。

圖4 不同溫度下培養(yǎng)滸苔F v/F m 變化

不同光照條件下,藻體F v/F m 變化有所不同,處理的前2 天中,所有條件下樣品都有相同幅度的降低,處理第三天時,光強400μmol/(m2·s)下比其他光強下的要顯著低14%～16%;到培養(yǎng)后期,則以160μmol/(m2·s)下要明顯較高,即160μmol/(m2·s)下藻體Fv/Fm 的降低總體較為平緩(圖5)。

圖5 不同光照條件下,滸苔F v/F m 值變化

光照實驗表明,滸苔在低光照條件下的實際量子效率要高于高光照條件,且最大量子效率的測定也進一步證實了該結果,表明高光照條件會引起滸苔光能利用效率的下降。但光照強度的上升對凈光合放氧速率有促進作用,說明盡管高光照強度會導致滸苔對光能利用效率的降低,但是藻體所吸收利用的光能仍處于較高水平且促進了光合放氧量的上升,在本實驗設定的光照范圍內,綠藻藻體隨光照強度上升而降低對所吸收光能的利用效率,但凈光合放氧速率則表現(xiàn)出隨光照強度的提高而上升的趨勢。

5 討論

滸苔藻體的生長需要較強的光照和適宜的鹽度、溫度。PSⅡ的最大光量子產量(Fv/Fm),是一個比較穩(wěn)定的值,在非環(huán)境脅迫條件下極少變化,當藻類在不適宜的光照照射時,其自身的光系統(tǒng)會發(fā)生不同程度的損傷,最終造成光合作用的下降,因此,可以作為表征滸苔對外界環(huán)境因子適用性的一個指標,指示滸苔生理狀態(tài)[5]。針對幼苗的生長階段,鹽度可以直接產生影響,高鹽條件會顯著降低滸苔所有受試群體幼苗的生長速率,在兩個近緣種之間具有明顯的差異。Shimada等[7]對整個日本沿海石莼屬綠藻的研究也關注到滸苔與緣管滸苔間地理分布的差異,發(fā)現(xiàn)滸苔主要分布在鹽度較低的河口,而緣管滸苔生活在鹽度較高的沿海區(qū)域,認為滸苔的物種形成是對低鹽適應性進化的結果。Cai等[8]進一步考察了不同鹽度梯度對石莼屬綠藻分布與季節(jié)變化規(guī)律的影響,同樣發(fā)現(xiàn)滸苔主要分布在低鹽海區(qū),并且不同地理居群對鹽度的適應范圍不同。

鹽度處理結果說明,在鹽度為0‰的條件下,滸苔對光能的利用能力下降顯著,漂浮滸苔對低鹽脅迫很敏感;之前有學者指出,滸苔在鹽度為0‰的條件下光合活性大幅減弱,不能正常生長,甚至很快死亡[9]。本試驗中漂浮滸苔在低鹽度條件下,PSⅡ活性較低,當鹽度恢復到其生長環(huán)境的正常值后,其PSⅡ活性也都能很快回升。而在鹽度10‰～40‰的條件下,滸苔F v/F m 未發(fā)生非常明顯的變化,說明滸苔對鹽度的適應能力很強,在較大的鹽度變化范圍內,其均能夠維持一定的光能利用能力。高鹽度條件下,F v/F m 呈迅速降低趨勢,有研究發(fā)現(xiàn),這是因為在高鹽脅迫下,滸苔內一系列機體變化,致使體內蔗糖及脯氨酸生成量增加,增加的蔗糖及脯氨酸又起到了高滲調節(jié)作用,使?jié)G苔藻體保持了較高的光和活性[10]。受長江沖淡水的影響,江蘇海域鹽度較山東海域偏低,這與滸苔和緣管滸苔分別在江蘇與青島沿海優(yōu)勢分布的調查結果相符[11-12]。上述研究均未涉及鹽度影響分布的方式與機制,本研究的發(fā)現(xiàn)可為相關深入研究提供線索。

鹽度在一定程度上影響藻細胞的滲透壓、漂浮性、營養(yǎng)鹽吸收及光合放氧等,過高或過低的鹽度均會對藻細胞造成傷害[13-14],并進一步影響海藻的生長[15],生活在鹽度不同的近海、河口等的海藻對鹽度的響應也各有差異。滸苔是一種廣鹽性綠藻,適鹽范圍約為7‰～53‰[16],并在鹽度為0‰的條件下可存活2～3周[17]。近期的研究表明,相比于緣管滸苔、滸苔的適鹽范圍略廣[18]。在不損傷細胞膜的前提下滸苔細胞可反復進行質壁分離,以適應高鹽、低鹽的環(huán)境[19]。劉榆莎等[19]研究的結果顯示,滸苔生長等生理特性對鹽度的響應受溫度的影響,具體表現(xiàn)在:在低溫15℃下,鹽度從10‰增加至25‰對滸苔生長的影響不顯著,而在正常溫度(22℃)下,鹽度增加促進了滸苔的生長。一般認為鹽度變化影響細胞的滲透平衡,但其對藻體的光合色素的影響也有較多的研究[20-22],鹽脅迫能夠破壞植物葉綠體的膜結構,葉綠素含量將隨葉綠體膜結構的解體而降低,進而降低植物的光合能力。有研究表明,藻體光合色素含量的下調可在一定程度上避免過多光能對藻體造成損傷[23],而光能利用效率的提高在一定程度上可以平衡因為色素含量的降低對生長的影響,環(huán)境脅迫會破壞光合生物的光合結構,損傷光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)的反應中心,降低電子傳遞速率,并進一步抑制PSⅡ的潛在活性[23]。相比于溫度,鹽度對滸苔葉綠體光合結構未造成顯著影響,表現(xiàn)為同一溫度下,兩個鹽度處理的滸苔具有相似的光系統(tǒng)Ⅱ的潛在活性而F v/F m 的降低顯示其電子傳遞速率的降低。溫度實驗結果表明,在20℃～30℃范圍內滸苔樣品F v/F m 較高,綠藻能夠保持較高的光能利用效率,尤其25℃時F v/F m達到最大,當溫度低于20℃時,滸苔對光能的利用能力隨溫度的降低而呈逐漸減弱的趨勢,說明滸苔樣品受到了低溫脅迫導致了光合作用利用率下降。而當溫度高于30℃時,滸苔同樣受到不利的影響,對光能的利用效率也明顯降低,通過溫度的實驗,認為20℃～30℃范圍是滸苔對光能有較高利用效率的溫度范圍。

光照實驗結果顯示,滸苔在60～140μmol/(m2·s)的條件下能較好地維持自身的光能轉化效率,顯示較強的光照和溫度能夠促進藻體的生長,滸苔對光強有廣泛的適應性,其中120μmol/(m2·s)最適合其孢子萌發(fā)生長,高光化學量子產量能夠反映藻體處于較高的光合作用水平,可以產生更多利于生長的化學因子[6]。方差分析顯示光照對藻體最大光化學量子產量的影響顯著。