劉靜，王佳，馬金海

免疫缺陷、著絲粒不穩(wěn)定和面部異常（ immunodeficiency,centromeric instability and facial anomalies，ICF）綜合征是一種極其罕見的常染色體隱性遺傳疾病[1]，截至 2019年全世界范圍內(nèi)僅有 70 多例報(bào)道[2]，因不易得到臨床血樣標(biāo)本，極大限制了對(duì)該病的長(zhǎng)期深入研究[3]。利用 EB 病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立永生化淋巴細(xì)胞系，可以保存家系成員完整的基因組，為今后長(zhǎng)期研究提供珍貴的材料[4]。本研究利用 EB 病毒轉(zhuǎn)染 ICF 綜合征家系外周血淋巴細(xì)胞，為原發(fā)性免疫缺陷病患者建立永生化細(xì)胞系提供可行性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 細(xì)胞和耗材 胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Hyclone公司；淋巴細(xì)胞分離液、青霉素/鏈霉素、環(huán)孢素 A（CyA）、丁酸鈉和植物凝集素均購(gòu)自美國(guó) Sigma公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；B95-8 細(xì)胞由卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州市潔凈技術(shù)研究所；CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó) Shellba 公司；-80 ℃ 超低溫冰箱購(gòu)自日本 Sanyo 公司；24、96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、25 cm2一次性培養(yǎng)瓶、凍存管均購(gòu)自美國(guó) Costar 公司；離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；FACSAria II 流式細(xì)胞分選儀購(gòu)自美國(guó)BD 公司。

1.1.3 樣本 2 歲女孩，因反復(fù)感染 1年余就診，體格檢查發(fā)現(xiàn)患兒面部發(fā)育異常（低耳位、眼距寬），輔助檢查免疫球蛋白 IgG、IgM、IgA 均低于正常，T 細(xì)胞數(shù)量正常，基因檢測(cè) CDCA7 基因復(fù)合雜合突變（c.974_975del p.Thr325Arg fs ter 17），確診為免疫缺陷、著絲粒不穩(wěn)定和面部異常綜合征。患兒為家系中先證者，其父母及姐姐無(wú)臨床癥狀。

1.2 方法

1.2.1 EB 病毒懸液的制備 將 B95-8 凍存細(xì)胞復(fù)蘇后重懸于 5 ml 完全培養(yǎng)液中（RPMIl640 中添加 20% 胎牛血清、鏈霉素/青霉素），移至 24 孔培養(yǎng)板，每孔 2 ml，置于 5% CO2、37 ℃ 條件下，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到 0.5×106個(gè)/ml，加入濃度為20 ng/ml 的佛波酯（TPA）200 ng、3 mmol/L 的丁酸鈉 0.6 mmol，室溫培養(yǎng) 6 h 后用完全培養(yǎng)液洗3 次，3500 r/min 離心 10 min，棄上清，在 10% FBS培養(yǎng)液中以 0.75×106個(gè)/ml 濃度重懸，10～14 d離心含有病毒的培養(yǎng)液后，使用 0.8 μm 濾膜過濾，上清液即為 EB 病毒液，4 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ICF 綜合征家系外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 取 ICF 綜合征家系（患兒、父親、母親及姐姐）和健康對(duì)照共 5 份外周肝素抗凝血各 3 ml，加入 3 ml PBS 等量稀釋，緩慢加于 4 ml 淋巴細(xì)胞分離液頂部，2000 r/min 室溫離心 20 min。將含有單個(gè)核細(xì)胞的中間層移至新的 15 ml 離心管中，重懸在 PBS 中，1500 r/min 室溫離心 10 min，小心棄去上清液，加入 3 ml ACK 使紅細(xì)胞破裂，室溫下靜置 3 min。加入 PBS，1500 r/min 室溫離心10 min，棄去上清。加入 15 ml 完全培養(yǎng)液，對(duì)各個(gè)樣本進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.3 EB 病毒轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞系的建立 ICF 綜合征家系 4 個(gè)樣本和 1 個(gè)健康對(duì)照樣本單個(gè)核細(xì)胞，加入 1 ml EB 病毒后重懸于 15 ml 離心管中，每個(gè)離心管中的單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量至少大于4.9×105個(gè)，放置在 5% CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱 1.5 h，1500 r/min 離心 10 min 后棄上清，加入 1 ml 完全培養(yǎng)液重懸，同時(shí)加入 20% FBS 及 0.5 μg/ml 環(huán)孢素 A，置于 96 孔板，每隔一周半量換液，且每次培養(yǎng)基中均加入濃度為 0.5 μg/ml 的環(huán)孢素 A。見淋巴細(xì)胞增大且形成大小不等的多個(gè)細(xì)胞團(tuán)時(shí)，以 1:3 傳代至 24 孔培養(yǎng)板，進(jìn)而轉(zhuǎn)至 25 cm2培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)。1 個(gè)月后可見較黑細(xì)胞團(tuán)，打散后很快再次形成團(tuán)塊狀，即獲得穩(wěn)定的淋巴細(xì)胞系。

1.2.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇 細(xì)胞凍存時(shí)將轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞系（細(xì)胞計(jì)數(shù) ＞ 2×106個(gè)），1500 r/min離心 10 min，棄上清液，在 500 μl 完全培養(yǎng)液中重懸，加 500 μl 細(xì)胞凍存液（10% DMSO 的胎牛血清 + 40% FBS）， 混勻后分裝于凍存管，置-80% 冰箱過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮中保存。凍存時(shí)行半量?jī)龃?，其余繼續(xù)培養(yǎng)傳代。

凍存細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，將凍存管取出后迅速放置5% CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱 2 min，融化后用 RPMI1640清洗，1500 r/min 離心 10 min，棄上清，加完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，取 10 μl 用臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)，細(xì)胞活性應(yīng)大于 90%。

2 結(jié)果

2.1 利用 B95-8 細(xì)胞系制備 EB 病毒

B95-8 細(xì)胞系為猴的淋巴瘤細(xì)胞，半貼壁生長(zhǎng)，可見桿狀及橢圓形細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞在視野中占2/3，且多為桿狀細(xì)胞，可加入 TPA 及丁酸鈉，促使細(xì)胞裂解，釋放 EB 病毒，此時(shí)可見少量大小不一的細(xì)胞團(tuán)塊，大概 10～14 d 培養(yǎng)液中所有細(xì)胞死亡（圖1）。

圖1 倒置顯微鏡觀察 B95-8 細(xì)胞系制備 EB 病毒（A：B95-8 細(xì)胞；B：加入 TPA 及丁酸鈉后細(xì)胞裂解，釋放 EB 病毒；C：10～14 d 后培養(yǎng)液中所有細(xì)胞已死亡，可見細(xì)胞碎片）Figure 1 B95-8 cell observation during the EBV preparation (A:B95-8 cells; B:After adding TPA and sodium butyrate,the cells lysed and released the EBV; C:Ten to fourteen days later,all the cells were dead in the media,and the cell fragments were visible)

2.2 采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè) ICF 綜合征家系 B細(xì)胞表達(dá)水平

該家系中患兒及其母親初始 B 細(xì)胞占總 B細(xì)胞比例較其他家庭成員及正常對(duì)照有下降。而患兒記憶 B 細(xì)胞在分化成熟階段出現(xiàn)障礙，比例明顯低于健康對(duì)照，但有大量的漿母細(xì)胞，故可行 EB病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立 ICF 綜合征家系永生化淋巴細(xì)胞系（圖2）。

圖2 正常對(duì)照者、患兒父親、患兒母親、患兒姐姐、患兒的 B 細(xì)胞表達(dá)水平Figure 2 The expression of B cells from normal control,the patient's father,mother,sister and the patient

2.3 建立 EB 病毒轉(zhuǎn)染 ICF 綜合征家系永生化淋巴細(xì)胞系

根據(jù)流式細(xì)胞技術(shù)對(duì) ICF 家系的 B 細(xì)胞分群分析的結(jié)果，選取不同濃度的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行 EB 病毒轉(zhuǎn)染，24 孔培養(yǎng)板可見細(xì)胞多于中央聚集，而在 96 孔培養(yǎng)板中細(xì)胞多于周圍壁聚集，B 細(xì)胞體積增大，變?yōu)閳A形、橢圓形，在光學(xué)顯微鏡下很難與 T 細(xì)胞辨別。每周半量換培養(yǎng)液，大概 2 周后T 細(xì)胞大量死亡，視野可見少量散在分布的圓形細(xì)胞，多數(shù)細(xì)胞逐漸聚集，成小團(tuán)或簇狀，細(xì)胞增殖旺盛，可轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞很快形成團(tuán)簇狀生長(zhǎng)，4～5 周后逐漸變大變黑，可傳代培養(yǎng)，表明成功獲得永生細(xì)胞系（圖3）。

圖3 轉(zhuǎn)染 4 周后倒置顯微鏡下永生化淋巴細(xì)胞的形態(tài)（× 100）Figure 3 Morphology of immortalized lymphocytes after four weeks under inverted microscope (× 100)

3 討論

ICF 綜合征是一類常染色體隱性遺傳的疾病，臨床上極其罕見，而此類患者不宜反復(fù)抽取血樣，也有患者因免疫缺陷重癥感染離世，這些寶貴的具有特定生物學(xué)性狀的資料也隨之丟失，嚴(yán)重影響我國(guó)對(duì)于罕見病發(fā)病機(jī)制的長(zhǎng)期深入研究，導(dǎo)致臨床醫(yī)生對(duì)此類疾病的認(rèn)識(shí)不足，易造成誤診漏診[5]。而利用 EB 病毒轉(zhuǎn)染外周血淋巴細(xì)胞，使其成為一種能連續(xù)分裂、體外可培養(yǎng)、永存的淋巴細(xì)胞系，保存家系成員完整的基因組，可為后期深入長(zhǎng)期研究提供保障[6]，也為原發(fā)性免疫缺陷病患者建立永生化細(xì)胞系提供可行性依據(jù)，對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不能明確診斷以及研究的珍貴樣本，長(zhǎng)期保存遺傳信息以便進(jìn)行回顧性研究具有重大意義[7]。

利用 EB 病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)得到永生化淋巴細(xì)胞的報(bào)道始見于 1985年[8]。目前國(guó)內(nèi)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)多為 EB 病毒轉(zhuǎn)染健康細(xì)胞后得到永生淋巴樣細(xì)胞系，對(duì)正常人體淋巴細(xì)胞體外分子生物學(xué)特征研究起到推動(dòng)作用，具有重要意義[9]。ICF 綜合征這類罕見疾病存在免疫缺陷，B 細(xì)胞增殖、活化、分化均存在不同程度的缺陷，轉(zhuǎn)染過程困難重重。本研究針對(duì)原發(fā)性免疫缺陷病，使用流式細(xì)胞儀重點(diǎn)對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行分群分析，使用最佳數(shù)量的外周血單個(gè)核細(xì)胞與 EB 病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并對(duì)轉(zhuǎn)染后的永生化細(xì)胞生長(zhǎng)周期進(jìn)行預(yù)判，在不同時(shí)期選擇換培養(yǎng)液或收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，最終成功地在 ICF家系獲得永生化淋巴細(xì)胞系。

正常人群外周血單個(gè)核細(xì)胞的提取技術(shù)已經(jīng)很成熟，但對(duì)于免疫缺陷的患者，需采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中淋巴細(xì)胞亞群比例[10]。ICF 家系中，初始 B 細(xì)胞比例基本正常，而患者記憶 B 細(xì)胞比例明顯低于健康對(duì)照，該患者的記憶 B 細(xì)胞在分化成熟階段出現(xiàn)障礙，但有大量的漿母細(xì)胞。根據(jù)流式細(xì)胞儀的結(jié)果，我們選取不同細(xì)胞濃度進(jìn)行 EB 病毒轉(zhuǎn)染，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況及培養(yǎng)液顏色進(jìn)行半量換液，且在換液時(shí)注意勿將移液器觸及培養(yǎng)瓶底部，培養(yǎng)液中加入 CyA（終濃度 0.5 μg/ml），以抑制可能殘留的 T 細(xì)胞活性。一個(gè)月后成功獲得永生化淋巴細(xì)胞系，細(xì)胞增殖活躍，可以不停傳代培養(yǎng)。同時(shí)我們對(duì)比 EB 病毒轉(zhuǎn)染凍存外周血單個(gè)核細(xì)胞和新鮮外周血單個(gè)核細(xì)胞，所需血量無(wú)明顯差別，操作相同，轉(zhuǎn)化效率、建系周期基本一致，在操作時(shí)需注意 EB 病毒轉(zhuǎn)染凍存外周血單個(gè)核細(xì)胞起初 1 小時(shí)可能會(huì)有大量黏滯的液體，為細(xì)胞破裂大量 DNA 釋放后的產(chǎn)物，無(wú)需反復(fù)吹打，如果病人 B 細(xì)胞總數(shù)較少，可將黏滯的液體另轉(zhuǎn)移至 96 孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。

對(duì)于凍存 EB 病毒轉(zhuǎn)染后的 ICF 家系永生淋巴細(xì)胞系，10% DMSO 作為滲透性冷凍保護(hù)劑，對(duì)淋巴細(xì)胞起到很好的冷凍保護(hù)作用[11]。復(fù)蘇后的細(xì)胞活性在 90% 以上，為 ICF 綜合征等罕見病體外長(zhǎng)期研究提供材料。對(duì)于目前無(wú)法明確病因和基因診斷的疾病建立永生化細(xì)胞系保存細(xì)胞基因組，保存罕見疾病珍貴的遺傳資料，以期日后進(jìn)一步研究，這個(gè)方法的建立對(duì)該病發(fā)病機(jī)制的免疫學(xué)研究具有重要意義。