姬廣超，王曉明，王玉琪，宋航飛

近些年，我們國(guó)家的細(xì)胞產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速。不論是干細(xì)胞技術(shù)還是免疫細(xì)胞技術(shù)，相關(guān)的科學(xué)研究都十分火熱，且有一部分機(jī)構(gòu)的相關(guān)產(chǎn)品已經(jīng)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段。不同于其他藥品，細(xì)胞產(chǎn)品是具有代謝能力的活細(xì)胞，保存方法和保存時(shí)間受到了很大的限制，影響了其應(yīng)用。

新鮮細(xì)胞產(chǎn)品保存時(shí)限較短，為了長(zhǎng)期保存細(xì)胞產(chǎn)品，通常進(jìn)行細(xì)胞凍存，保存在-80 ℃ 冰箱或是-196 ℃ 的液氮環(huán)境下。細(xì)胞凍存過程對(duì)細(xì)胞有傷害，所以需要細(xì)胞凍存保護(hù)液來減低細(xì)胞的損傷。實(shí)驗(yàn)室常用的細(xì)胞凍存保護(hù)液配方是 10% 二甲基亞砜（DMSO）+ 90% 胎牛血清（FBS），通用性好，細(xì)胞保護(hù)效果好，受到了廣泛認(rèn)可。但其配方中含有動(dòng)物來源的 FBS，有無法消除的安全隱患。所以，用可臨床應(yīng)用的成分替代 FBS 具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用可臨床應(yīng)用的成分替代 FBS，探索一種可供臨床應(yīng)用的細(xì)胞凍存保護(hù)液。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 細(xì)胞樣本由上海安庫(kù)生醫(yī)生物科技有限公司細(xì)胞庫(kù)提供。

1.1.2 儀器 HFsafe-1200LC 生物安全柜/HF90 二氧化碳培養(yǎng)箱為力康生物醫(yī)療科技控股有限公司產(chǎn)品；L535-1 低速離心機(jī)為湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品；Countstar IC-1000 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀為上海睿鈺生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要試劑 6% 羥乙基淀粉 130/0.4 氯化鈉注射液購(gòu)自費(fèi)森尤斯；二甲基亞砜購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；人血白蛋白購(gòu)自上海萊士血液制品股份有限公司；胎牛血清購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)股份有限公司；0.9% 氯化鈉注射液購(gòu)自安徽雙鶴藥業(yè)；葡萄糖購(gòu)自碧云天生物；右旋糖酐購(gòu)自上海泰坦科技股份有限公司；MSC FreezIS DMSO-Free 購(gòu)自 Irvine Scientific 公司。

1.2 方法

本實(shí)驗(yàn)采用外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSC）各 6 個(gè)樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。選取庫(kù)存細(xì)胞樣本，復(fù)蘇后培養(yǎng) 24～48 h 后，收獲計(jì)數(shù)。細(xì)胞定容至550～600 μl，取 100 μl 分別加入含 900 μl 不同細(xì)胞凍存保護(hù)液的 2 ml 凍存管中。放入程序降溫盒移至-80 ℃ 冰箱，過夜轉(zhuǎn)移至液氮罐保存。30 d 后，取出細(xì)胞，37 ℃ 水浴鍋快速融化?；靹蚣?xì)胞并使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)法計(jì)數(shù)。統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)結(jié)果：活細(xì)胞復(fù)蘇率 = 凍存后活細(xì)胞數(shù)/凍存前活細(xì)胞數(shù)，使用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS 26.0 進(jìn)行單因素方差分析。不同凍存保護(hù)液配方見表1。

表1 不同凍存保護(hù)液配方

2 結(jié)果

2.1 PBMC 組不同配方凍存保護(hù)液活細(xì)胞復(fù)蘇率

PBMC 組不同配方凍存保護(hù)液活細(xì)胞復(fù)蘇率（表2）以配方 B 的凍存保護(hù)效果最好，差異顯著（P＜ 0.05）。

表2 PBMC 組不同配方凍存保護(hù)液活細(xì)胞復(fù)蘇率

2.2 UC-MSC 組不同配方凍存保護(hù)液活細(xì)胞復(fù)蘇率

UC-MSC 組不同配方凍存保護(hù)液活細(xì)胞復(fù)蘇率（表3）以配方 C 的凍存保護(hù)效果最好，差異極顯著（P＜ 0.01）。

表3 UC-MSC 組不同配方凍存保護(hù)液活細(xì)胞復(fù)蘇率

2.3 不分組不同配方凍存保護(hù)液活細(xì)胞復(fù)蘇率

不分組不同配方凍存保護(hù)液活細(xì)胞復(fù)蘇率（表4）以配方 C 的凍存保護(hù)效果最好，差異極顯著（P＜ 0.01）。通過多重比較（表5），可見配方 B 的凍存保護(hù)效果雖然次于配方 C，但兩者差異不顯著。所以，配方 B 有望作為配方C 的替代方案，并有望成為一種可臨床應(yīng)用的凍存保護(hù)液方案。

表4 不分組不同配方凍存保護(hù)液活細(xì)胞復(fù)蘇率

表5 不分組不同配方凍存保護(hù)液活細(xì)胞復(fù)蘇率多重比較

3 討論

細(xì)胞凍存保護(hù)液主要依靠其中的冷凍保護(hù)劑成分來實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞凍存過程中保護(hù)細(xì)胞的作用。冷凍保護(hù)劑根據(jù)其是否穿透細(xì)胞膜通常分為兩大類型：滲透性冷凍保護(hù)劑和非滲透性冷凍保護(hù)劑。滲透性冷凍保護(hù)劑多為小分子中性物質(zhì)，主要包括甘油、DMSO、丙二醇、乙二醇、乙酰胺、甲醇等。非滲透性保護(hù)劑多為大分子物質(zhì)，主要包括海藻糖、聚乙二醇、羥乙基淀粉、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖、白蛋白等[1]。

DMSO 是最常用的凍存保護(hù)劑和常用藥用輔料，在國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心常用藥用輔料數(shù)據(jù)庫(kù)可以查詢到其詳細(xì)信息，但沒有最大注射用量信息。美國(guó) FDA官方網(wǎng)站，可以查詢到的造血祖細(xì)胞、臍帶血靜脈注射用懸液的處方信息里提到，“二甲基亞砜的最大耐受劑量尚未確定，但靜脈注射時(shí)一般不超過 1 g/(kg·d) 的劑量”。目前并沒有藥用注射級(jí)別的 DMSO 產(chǎn)品。

凍存液中加入 FBS，可補(bǔ)給細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)、增殖細(xì)胞因子、穩(wěn)定培養(yǎng)液 pH 值及營(yíng)造高濃度蛋白狀態(tài)，對(duì)保護(hù)細(xì)胞有重要意義[2]。FBS 為異種血清，且其成分不明，不能用于臨床。許多學(xué)者嘗試用其他成分替代 FBS。游小燕等[3]用蔗糖、乙二醇、DMEM 替代 FBS 去凍存豬胎兒成纖維細(xì)胞；趙滿倉(cāng)等[4]用羥乙基淀粉、人血白蛋白和甘油替代 FBS 去凍存 DC 細(xì)胞，都取得了較好的效果。張麗娟等[5]采用其他臨床可用成分（人血白蛋白、復(fù)方電解質(zhì)注射液）來代替臨床不可用成分（FBS 和細(xì)胞培養(yǎng)基），探索研究一種可供臨床應(yīng)用的細(xì)胞凍存保護(hù)劑，但并沒有提供其凍存液與常用凍存液之間凍存效果的對(duì)比。

Park 等[6]通過實(shí)驗(yàn)證明了人血白蛋白（HSA）、人血清（HS）或敲除血清替代物（KSR）可以替代 FBS 用于人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的冷凍保存。Niknejad 等[7]使用人羊水來替代 FBS 凍存人羊膜上皮細(xì)胞，結(jié)果顯示（含羊水的凍存保護(hù)液和含胎牛血清的凍存保護(hù)液）凍存細(xì)胞的存活率無顯著差異。Ray 等[8]研制了一種無血清無毒性的 10% PVP/0.9%NaCl/60 mmol/L 依克多因的凍存保護(hù)液，用來凍存人脂肪來源的干細(xì)胞，存活率可高達(dá) 81%。Martina 等[9]使用絲膠蛋白替代凍存保護(hù)液中的 FBS 和 DMSO，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在凍存人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，絲膠蛋白可以替代凍存保護(hù)液中的 FBS，卻不能替代凍存保護(hù)液中的 DMSO。Yoshitake 等[10]使用超快速冷凍（superflash freezing，SFF）來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的無凍存保護(hù)劑的凍存方法，該方法已在小鼠成纖維細(xì)胞 3T3 細(xì)胞、小鼠成肌細(xì)胞 C2C12 細(xì)胞以及大鼠原代間充質(zhì)干細(xì)胞等的凍存上獲得了驗(yàn)證。該無凍存保護(hù)劑方法是否適合絕大多數(shù)細(xì)胞，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究中使用的凍存保護(hù)液，不考慮實(shí)驗(yàn)室常用的配方C，配方 E 是采用的無 DMSO 的商品化凍存保護(hù)液，其他配方的成分中除 DMSO 外，皆有相應(yīng)的臨床藥品提供。其中由于無法購(gòu)買到右旋糖酐注射液，所以用氯化鈉注射液、葡萄糖、右旋糖酐按照右旋糖酐注射液（右旋糖酐氯化鈉注射液、右旋糖酐葡萄糖注射液）的比例配制替代臨床藥品成分來驗(yàn)證凍存液配方。本研究中，比較不同凍存保護(hù)液配方的凍存保護(hù)效果時(shí)，細(xì)胞凍存時(shí)間僅 30 天，檢測(cè)指標(biāo)也僅限于凍存細(xì)胞的活細(xì)胞復(fù)蘇率，沒有對(duì)復(fù)蘇后細(xì)胞的增殖能力以及腫瘤殺傷活性等做進(jìn)一步檢測(cè)，存在一定的局限性。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，凍存保護(hù)液的配方 B 和配方 C具有良好的細(xì)胞凍存保護(hù)效果。不分組統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，配方 C的活細(xì)胞復(fù)蘇率略高于配方 B，但兩者差異不顯著。研究的結(jié)果初步提示：在 DMSO 的臨床風(fēng)險(xiǎn)可接受的情況下，凍存保護(hù)液配方 B 有望成為可供臨床應(yīng)用的凍存保護(hù)液，提高細(xì)胞產(chǎn)品的可用性和廣泛性，能使更多的目標(biāo)人群受益。

與實(shí)驗(yàn)室常用的凍存保護(hù)液成分及其配方相比，選用已獲得國(guó)藥準(zhǔn)字的注射級(jí)藥品作為凍存保護(hù)液成分（如配方B），在不顯著降低凍存保護(hù)液對(duì)細(xì)胞保護(hù)效果的同時(shí)，還能夠進(jìn)一步提高凍存保護(hù)液自身在臨床應(yīng)用上的安全性；其產(chǎn)品成為某些種類的細(xì)胞治療產(chǎn)品優(yōu)選的凍存保護(hù)液，甚至有可能滿足經(jīng)深低溫冷凍和保藏的細(xì)胞治療產(chǎn)品在復(fù)蘇后直接輸入人體的要求，但其是否能最終成為可以直接輸入人體的臨床級(jí)細(xì)胞凍存保護(hù)液，尚有待進(jìn)一步的相關(guān)研究和臨床試驗(yàn)的證明。