唐梁， 梁偉海， 陳志寧， 林國(guó)偉， 劉曉俊*， 歐陽(yáng)櫻君

（廣州市第一人民醫(yī)院 1 中醫(yī)科， 2 神經(jīng)內(nèi)科， 廣東 廣州510180）

卒中后認(rèn)知障礙 （PSCI） 是腦卒中的重要并發(fā)癥， 發(fā)病率極高 （80.97%）［1－2］， 對(duì)患者的自理能力及生存質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。 著名中醫(yī)腦病專家劉茂才教授研制出治療PSCI 的癡復(fù)康方， 其臨床療效顯著， 但作用機(jī)制尚未明確。 NR2B／CaMKⅡ信號(hào)通路廣泛存在于腦神經(jīng)元中， 促進(jìn)神經(jīng)突觸的重塑、 學(xué)習(xí)、 記憶功能， HMGB－1、 TGF－β1／Smad 信號(hào)通路在PSCI 發(fā)病過(guò)程中誘導(dǎo)神經(jīng)元的損傷和凋亡。 基于此， 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)48 只大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎制作PSCI 模型， 觀察癡復(fù)康方對(duì)大鼠的空間學(xué)習(xí)、 記憶能力的改善情況， 檢測(cè)NR2B／CaMKⅡ信號(hào)通路及HMGB－1、 TGF－β1／Smad 信號(hào)通路以闡明其可能的作用機(jī)制， 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD 大鼠48 只， 雄性， 體重180 ～220 g， 由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 ［許可證號(hào)： SCXK （粵） 2018－0002］。

1.2 造模

SD 大鼠分離出左右頸總動(dòng)脈， 用止血鉗夾住近心端頸總動(dòng)脈， 用彎頭鑷排空遠(yuǎn)心端血管中的血液， 對(duì)雙側(cè)頸總動(dòng)脈行兩點(diǎn)結(jié)扎。

1.3 分組及給藥方法

將48 只SD 大鼠隨機(jī)分為正常組、 模型組、 尼莫地平組以及癡復(fù)康方低、 中、 高劑量組， 每組8 只。 正常組實(shí)施假手術(shù)， 其余均實(shí)施雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)。 低、 中、 高劑量組分別予以癡復(fù)康0.22 g·kg－1·d－1、 0.44 g·kg－1·d－1、 0.88 g·kg－1·d－1灌胃， 尼莫地平組予以尼莫地平1 mg·kg－1·d－1， 模型組、 正常組予以生理鹽水10 mL·kg－1·d－1， 均為1 次／d， 連續(xù)30 d。

1.4 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試大鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力

1.4.1 獲得性訓(xùn)練

將水迷宮裝置水池分為4 個(gè)象限， 平臺(tái)置于其中一個(gè)象限區(qū)的中央。 將大鼠頭朝池壁放入水中， 記錄動(dòng)物找到水下平臺(tái)的時(shí)間 （s）， 連續(xù)訓(xùn)練5 d。

1.4.2 定向航行實(shí)驗(yàn)

第30 d 藥后1 h， 將大鼠面向池壁放入水中， 入水順序?yàn)棰笙笙蕖裣笙蕖粝笙蕖蛳笙蓿?記錄90 s 內(nèi)大鼠登上平臺(tái)并停留3 s 所用時(shí)間， 即逃避潛伏期 （s）， 超過(guò)90 s 記為90 s。

1.4.3 空間探索實(shí)驗(yàn)

完成定向航行測(cè)試后， 立即撤去平臺(tái)， 將大鼠從原平臺(tái)象限對(duì)側(cè)第Ⅰ象限面向池壁放入水中， 記錄90 s 內(nèi)大鼠穿越原平臺(tái)次數(shù) （次） 和原平臺(tái)象限停留時(shí)間 （s）。

1.5 病理切片觀察

各組大鼠取腦組織， 經(jīng)過(guò)固定、 脫水、 包埋、 切片、 染色， 在顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 qPCR 法檢測(cè)大鼠腦組織中NR2B、 CaMKⅡ、 HMGB-1、TGF-β1、 Smad7 mRNA 的表達(dá)量

根據(jù)Trizol 總RNA 提取試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA， 測(cè)定濃度和純度， 取500 ng 總RNA 用于cDNA 合成， 根據(jù)TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)， 檢測(cè)mRNA 的表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。 計(jì)量資料符合正態(tài)分布的， 以± s 表示， 采用單因素方差分析， 多重比較采用LSD 法，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癡復(fù)康方對(duì)大鼠逃避潛伏期、 穿越原平臺(tái)次數(shù)、 原平臺(tái)象限停留時(shí)間的影響

與正常組相比， 模型組的逃避潛伏期延長(zhǎng)， 穿越原平臺(tái)次數(shù)減少， 原平臺(tái)象限停留時(shí)間縮短， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.01）。 與模型組相比， 低、 中、 高劑量組逃避潛伏時(shí)間均縮短， 原平臺(tái)象限停留時(shí)間均延長(zhǎng)， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.01）。 與模型組相比， 中、 高劑量組穿越原平臺(tái)次數(shù)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.01）。 見(jiàn)表1。

表1 癡復(fù)康方對(duì)大鼠逃避潛伏期、 穿越原平臺(tái)次數(shù)和原平臺(tái)象限停留時(shí)間的影響 （ ± s）

表1 癡復(fù)康方對(duì)大鼠逃避潛伏期、 穿越原平臺(tái)次數(shù)和原平臺(tái)象限停留時(shí)間的影響 （ ± s）

注： 與正常組比較， aP ＜0.01； 與模型組比較， bP ＜0.01。

組別 n 逃避潛伏期 （s） 穿越原平臺(tái)次數(shù)（次）原平臺(tái)象限停留時(shí)間 （s）高劑量組 8 43.89±7.56b 7.502±1.61b 25.79±9.17b中劑量組 8 52.49±10.13b 6.501±1.60b 24.05±7.67b低劑量組 8 62.27±9.32b 4.875±2.03 23.44±4.02b尼莫地平組 8 46.22±10.57 7.125±1.25 25.16±4.87模型組 8 68.63±14.43a 3.625±1.06a 10.15±3.90a正常組 8 51.67±9.80 8.250±1.49 26.88±3.43

2.2 病理切片觀察

模型組大鼠海馬神經(jīng)元明顯減少， 細(xì)胞排列松散， 不規(guī)則， 部分可見(jiàn)核仁消失、 錐體細(xì)胞減少； 癡復(fù)康方低、 中、 高劑量組隨著劑量增加， 大鼠海馬組織神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)改善明顯， 神經(jīng)元增加， 壞死細(xì)胞明顯減少， 細(xì)胞核固縮減少， 正常神經(jīng)元增加， 細(xì)胞輪廓清晰， 排列整齊， 其中以高劑量組改善最明顯。 見(jiàn)圖1。

圖1 病理改變HE 染色 （×100）

2.3 癡復(fù)康方對(duì)NR2B、 CaMKⅡ的影響

與正常組相比， 模型組的NR2B、 CaMKⅡ表達(dá)減少， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.01）； 與模型組相比， 低、 中、 高劑量組的NR2B、 CaMKⅡ表達(dá)均增加， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 癡復(fù)康方對(duì)NR2B、 CaMKⅡ的影響 （ ± s）

表2 癡復(fù)康方對(duì)NR2B、 CaMKⅡ的影響 （ ± s）

注： 與正常組比較， aP ＜0.01； 與模型組比較， bP ＜0.01； 與尼莫地平組比較， cP ＜0.01。

組別 n NR2B CaMKⅡ高劑量組 8 0.88±0.05b 0.95±0.16b中劑量組 8 0.42±0.03bc 0.72±0.05b低劑量組 8 0.44±0.05bc 0.60±0.07bc尼莫地平組 8 0.97±0.11 0.90±0.13模型組 8 0.16±0.01a 0.13±0.01a正常組 8 1.00±0.09 1.00±0.06

2.4 癡復(fù)康方對(duì)HMGB-1、 TGF-β1、 Smad7 的影響

與正常組相比， 模型組的HMGB－1、 TGF－β1、 Smad7 表達(dá)均增加， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.01）； 與模型組相比， 中、高劑量組的HMGB－1 表達(dá)均減少， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.01）； 與模型組相比， 低、 中、 高劑量組的TGF－β1、 Smad7表達(dá)均減少， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＜0.01）。 見(jiàn)表3。

表3 癡復(fù)康方對(duì)HMGB-1、 TGF-β1、 Smad7 的影響 （ ± s）

表3 癡復(fù)康方對(duì)HMGB-1、 TGF-β1、 Smad7 的影響 （ ± s）

注： 與正常組比較， aP ＜0.01； 與模型組比較， bP ＜0.01； 與尼莫地平組比較， cP ＜0.01。

組別 n HMGB－1 TGF－β1 Smad7高劑量組 8 1.01±0.26b 0.92±0.05b 0.92±0.05b中劑量組 8 1.17±0.44b 1.83±0.10bc 1.83±0.10bc低劑量組 8 2.17±0.26c 2.27±0.16bc 2.27±0.16bc尼莫地平組 8 1.14±0.13 1.14±0.13 1.14±0.13模型組 8 2.21±0.23a 2.58±0.18a 2.58±0.18a正常組 8 1.00±0.10 1.00±0.09 1.00±0.09

4 討論

卒中后認(rèn)知障礙 （PSCI） 的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，有相關(guān)研究［3］認(rèn)為其可能與腦關(guān)鍵部位血管損害、 腦神經(jīng)退行性病變、 腦部炎性反應(yīng)及遺傳有關(guān)。 N－甲基－D－天門冬氨酸（NMDA） 受體是一種分布在大腦海馬和皮層的離子通道型谷氨酸受體， 通過(guò)調(diào)控突觸可塑性和神經(jīng)元突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)，在學(xué)習(xí)、 記憶方面起重要作用。 NR2B 作為NMDA 受體的重要功能亞基， 對(duì)于前額葉皮層神經(jīng)元突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)的形成以及依賴前額葉皮層相關(guān)記憶的形成發(fā)揮重要作用［4］。 CaMKⅡ是大腦組織內(nèi)的非脯氨酸依賴蛋白激酶， 是學(xué)習(xí)、 記憶的分子基礎(chǔ)， 參與神經(jīng)元突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)。 NR2B 被激活后，促進(jìn)Ca2＋內(nèi)流激活CaMKⅡ， 刺激CaMKⅡ下游信號(hào)通路， 引起突觸后膜致密區(qū)磷酸化， 促進(jìn)神經(jīng)元突觸長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)， 促進(jìn)NR2B 表達(dá)， 從而增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力［5］。 但NR2B 過(guò)度表達(dá)會(huì)引起神經(jīng)元內(nèi)Ca2＋超載而損害神經(jīng)元， 導(dǎo)致疾病發(fā)生［6］。NR2B／CaMKⅡ信號(hào)通路存在雙向作用， 既能改善認(rèn)知功能，也可損害認(rèn)知功能， 所以調(diào)節(jié)NR2B／CaMKⅡ信號(hào)通路是治療認(rèn)知功能障礙的重要靶點(diǎn)。

炎性因子在認(rèn)知功能障礙發(fā)病中也起到重要的作用。HMGB－1 是組織受到缺血缺氧等刺激后大量釋放至細(xì)胞外的促炎性因子， 會(huì)加劇機(jī)體炎癥［7-8］。 相關(guān)研究［9］表明， HMGB－1在血管性癡呆患者血清中高表達(dá)， 且與其嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，與患者預(yù)后有明顯相關(guān)性。 TGF－β1／Smad 信號(hào)通路參與血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制［10］： TGF－β1 在海馬等組織中表達(dá)， 與細(xì)胞膜受體結(jié)合， 使Smad 磷酸化， 調(diào)節(jié)靶向基因的表達(dá)， 其中Smad7 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 癡復(fù)康方能夠改善PSCI 大鼠的空間學(xué)習(xí)、 記憶能力， 其機(jī)制可能與減少海馬神經(jīng)元壞死， 上調(diào)海馬組織NR2B、 CaMKⅡmRNA 表達(dá)， 下調(diào)HMGB－1、 TGF－β1、Smad7 mRNA 表達(dá)有關(guān)， 其治療PSCI 的詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。