鄧任堂，許紅麗，孔桂興，賴麗莎，揭育幫，陳梅蓮，付文金（.廣東省東莞市厚街醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 53945；.湖南省武岡市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南邵陽(yáng) 4400）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是嚴(yán)重影響人類身心健康的重大疾病之一。對(duì)于確診患者，最有效的治療方法就是藥物降糖治療。然而，不同的T2DM患者在使用降糖藥治療過(guò)程中，在藥代動(dòng)力學(xué)、療效以及不良反應(yīng)中存在顯著的個(gè)體差異，這是藥物基因組學(xué)導(dǎo)致的，其中磺脲類受體1(sulfonylurea receptor 1，ABCC8)[1]，轉(zhuǎn)錄因子7 類似物2(transcription factor 7～like 2，TCF7L2)[2-3]，胰島素受體底物1(insulin receptor substrate～1，IRS1)[4-5]，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxidase proliferation of activated receptor～γ2,PPARγ2）[6]，有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與多藥和有毒化合物排出家族(organic cation transporters and multidrug and toxin extrusion proteins，SLC47A1,SLC22A1)[7]，有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員1B1(Organic Anion Transporters 1B1，SLCO1B1)[8-10]等有重要臨床意義。但目前常用檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）的方法并不能很好地滿足臨床需求。液相芯片技術(shù)作為新一代高通量檢測(cè)技術(shù)，特別適用于SNPs檢測(cè)，在臨床各方面發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。本研究旨以液相芯片技術(shù)，通過(guò)多重PCR 聯(lián)合等位基因特異性引物延伸（allele specific primer extension,ASPE），建立一次性檢測(cè)上述7個(gè)目標(biāo)基因型的方法，以期為臨床選擇適宜降糖藥，減少不良反應(yīng)，提高藥效提供實(shí)驗(yàn)室支持。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 115例患者為2019年1～12月我院新診2型糖尿病患者，均符合WHO 頒布的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中男性63例，女性52例，年齡52～76歲，中位年齡65歲。所有患者均簽署知情同意書，并通過(guò)東莞市厚街醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，厚街倫理編號(hào)：[2019]倫審第(023)號(hào)。

1.2 試劑和儀器 多重PCR 試劑盒TaqTMHot Start Version（日 本TaKaRa 公司），DNA提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit（北京天根生化科技有限公司），核酸外酶I～蝦堿性磷酸酶（ExoSAP～I(xiàn)）,PlatinumTM GenoType Tsp DNA聚合酶、鏈霉親和素-澡紅蛋白（SA～PE）,Biotin～dCTP，dNTPs等（美國(guó)賽默飛世爾科技公司），偶合Anti-Tag 序列微球（美國(guó)Luminex 公司），LifeECO 基因擴(kuò)增儀（中國(guó)透景生命科技有限公司），蛋白核酸分析儀（英國(guó)豪沃生物科技有限公司），DYY-6C型電泳儀（北京六一生物有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集與DNA 提?。翰捎肊DTA-K2抗凝管采集患者空腹外周血2ml，按照試劑盒說(shuō)明書提取DNA，使用蛋白核酸分析儀調(diào)整樣本DNA濃度至25～30 ng/μl。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)及合成：參照課題組之前做法[11]，根據(jù)7個(gè)目的基因的rs號(hào)，在Genbank 中查找其靶位點(diǎn)附近堿基序列，以PrimerPlex 軟件設(shè)計(jì)特異性的ASPE 引物，Primer6.0 軟件設(shè)計(jì)含檢測(cè)位點(diǎn)的PCR 引物。委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成所有引物。引物及微球信息見(jiàn)表1。

1.3.3 多重PCR系統(tǒng)：反應(yīng)總體系共50μl，其中含DNA樣本2μl，5 U/μl TaqTMHot Star DNA 聚合酶 0.25μl，10xTaqTMHot Star DNA 聚合酶緩沖液5μl，10mmol/L dNTP 4μl，上下游混合引物8μl，超純水30.75μl?；旌衔锵? 000×g 離心10s，94℃預(yù)變性30s 后，94℃30s，57℃30s，72℃30s，5個(gè)循環(huán)；接著94℃ 30s，55℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃10 min 終止延伸。同時(shí)以超純水作空白對(duì)照。

1.3.4 PCR 產(chǎn)物純化：取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物5μl 與ExoSAP-IT 2.5μl 混合，37℃孵育30min，80℃反應(yīng)20 min。

1.3.5 ASPE 反應(yīng)：反應(yīng)總體系20μl，含純化PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物2μl，TAG-ASPE 引物混合液1μl，400μmol/L Biotin-dCTP 0.3μl，300μmol/L dATP/dGTP/dTTP 混合液1μl，10×TaqTMHot Star DNA聚合酶緩沖液2μl，5U/μl TaqTMHot Start DNA聚合酶0.12μl，100μmol/L dCTP 0.4μl，超純水13.18μl。混合物先3 000×g 離心10s，接著94℃30s，55℃30s，74℃1min，40個(gè)循環(huán)。

1.3.6 雜交反應(yīng)：以1.5×四甲基氯化氨（tetramethylammonium chloride，TMAC）雜交緩沖液混合14種MagPlex-TAG 微球，并稀釋至每種微球約50個(gè)/μl。取上述混合液25μl 與ASPE 反應(yīng)產(chǎn)物2μl 混合，先96℃90s，37℃45min，然后加入100μl 含7.5μg/ml SA-PE的1×TMAC雜交緩沖液，經(jīng)37℃孵育20 min 后，以Luminex 200檢測(cè)熒光信號(hào)。

表1 7個(gè)目的基因的相關(guān)引物及微球信息

1.3.7 結(jié)果判讀與基因分型：Luminex 200檢測(cè)系統(tǒng)可直接輸出MFI 和MFI 比率。MFI 比率=MFI目標(biāo)堿基/（MFI野生型+MFI突變型）。MFI 比率>0.75或<0.25 判為野生型或突變純合子，而0.25～0.75則判為雜合子。

1.3.8 多重PCR 及ASPE 反應(yīng)條件優(yōu)化：多重PCR優(yōu)化：依引物Tm值選擇50～60℃梯度退火溫度，分別檢測(cè)100，50，25，12.5 和6ng DNA濃度樣本，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果對(duì)7 對(duì)引物間的比例、循環(huán)次數(shù)、退火時(shí)間及Mg2+/dNTP/Taq濃度等進(jìn)行調(diào)整。ASPE 反應(yīng)條件優(yōu)化：根據(jù)MFI 和MFI 比率結(jié)果，調(diào)整ASPE 反應(yīng)體系中退火溫度及Biotion-dCTP，dCTP濃度等。

1.3.9 方法學(xué)性能評(píng)價(jià)：①重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：參照李婧嬋等[12]方法，用五份代表性樣本進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。②最低檢測(cè)限：參照PICKERING 等[13]方法，以DNA濃度200 ng為基礎(chǔ)，倍比稀釋至0.75ng，對(duì)各濃度樣本重復(fù)檢測(cè)三次，以三次均能清晰分辨基因型所對(duì)應(yīng)的濃度為最低檢測(cè)限。③特異性試驗(yàn)：參照李婧嬋等[12]方法，不同的單個(gè)靶位點(diǎn)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物分別與另外的ASPE 引物進(jìn)行混合，檢測(cè)信號(hào)的特異性。④準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)：選擇25份樣本，分別用本實(shí)驗(yàn)建立的方法和Sanger 測(cè)序法進(jìn)行檢測(cè)，兩者結(jié)果對(duì)比分析。

表2 5份標(biāo)本等位基因MFI 及MFI 比率 [n（%）]

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用非配對(duì)t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 方法學(xué)建立 7個(gè)目標(biāo)基因經(jīng)PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳成像后清楚可見(jiàn)七條目標(biāo)條帶，無(wú)非特異性條帶；經(jīng)優(yōu)化ASPE 雜交條件，選擇退火溫度55℃，Biotion-dCTP濃度與dCTP濃度的比值為3∶1，37℃孵育45 min時(shí)檢測(cè)效果最佳。

2.2 方法學(xué)性能評(píng)價(jià) 采用本實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)倍比稀釋標(biāo)本，最低檢測(cè)限可達(dá)0.75ng，以DNA濃度為50ng時(shí)分辨率最高。表2反映5份樣本MFI 及MFI比率結(jié)果。從重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，MFI 批內(nèi)批間CV偏高，分別達(dá)26.3%和33.7%；但純合子MFI比率批內(nèi)批間CV在0.9%～3.3%和2.1%～4.6%；雜合子MFI 比率批內(nèi)批間CV在2.9%～7.3%和5.2%～11.2%。結(jié)果見(jiàn)表3。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示不含靶位點(diǎn)時(shí)MFI值均小于250，含靶位點(diǎn)MFI值可高達(dá)1 000以上。以本實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)25份樣本，與測(cè)序結(jié)果完全一致，準(zhǔn)確度達(dá)100%。

表3 5份標(biāo)本相關(guān)基因型批內(nèi)批間MFI，MFI 比率及CV值

3 討論

2型糖尿病是全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題。我國(guó)糖尿病患者已超過(guò)1億，是糖尿病第一大國(guó)。對(duì)于確診T2DM患者，最有效的治療方法就是藥物降糖治療。臨床常用口服降糖藥物主要包括磺脲類、雙胍類、噻唑烷二酮類、氯苯茴酸類和α 葡萄糖苷酶抑制劑類。研究已證實(shí)藥物基因組學(xué)可導(dǎo)致不同患者使用降糖藥治療時(shí)，在藥代動(dòng)力學(xué)、療效以及不良反應(yīng)中存在顯著的個(gè)體差異。相關(guān)研究已篩選出幾十個(gè)與藥物治療反應(yīng)相關(guān)的基因位點(diǎn)，其中ABCC8，TCF7L2，IRS1，PPARγ2，SLC47A1,SLC22A1 和SLCO1B1 等有重要臨床意義。

目前，檢測(cè)基因多肽性的方法主要有：固相芯片法、PCR 法、測(cè)序法等，但這些方法通量低，成本高，耗時(shí)長(zhǎng)、敏感度和特異度低，操作復(fù)雜，或需特殊儀器，從而限制其應(yīng)用[14]。液相芯片技術(shù)為新一代高通量檢測(cè)技術(shù)，操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、重復(fù)性好，特別適用于SNPs檢測(cè)，在臨床各個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用越來(lái)越多。本研究以 Luminex 200為平臺(tái)，成功建立了高效便捷檢測(cè)2型糖尿病降糖藥相關(guān)藥物基因型的方法，本方法靈敏度、重復(fù)性、特異性及準(zhǔn)確性均較理想，有望為臨床選擇適宜口服降糖藥，減少不良反應(yīng)，提高藥效提供實(shí)驗(yàn)室支持。

影響Luminex 液相芯片方法學(xué)建立的因素較多，關(guān)鍵在于多重PCR 反應(yīng)體系，ASPE 雜交條件等。（1）在構(gòu)建多重PCR 反應(yīng)體系時(shí)，為保證擴(kuò)增的特異性，要重點(diǎn)關(guān)注兩個(gè)指標(biāo)：①各引物間Tm 差值。為避免各目的基因之間發(fā)生非特異性擴(kuò)增，在設(shè)計(jì)PCR 引物時(shí)盡可能的減少各引物間Tm差值。本試驗(yàn)中各引物間Tm 差值小于2℃；②退火溫度，退火溫度決定PCR 特異性，退火溫度高特異性強(qiáng)，退火溫度低則非特異性產(chǎn)物增加，合理的退火溫度從55℃～70℃。本試驗(yàn)從50℃開(kāi)始探索，直到將前5個(gè)PCR 循環(huán)退火溫度設(shè)為57℃時(shí)，取得較好效果。（2）在摸索ASPE 雜交條件時(shí)，首先，要避免ASPE 引物之間發(fā)生交叉延伸，這可通過(guò)調(diào)整多重PCR 延伸溫度得以解決。其次，ASPE 反應(yīng)體系中Biotion-dCTP濃度與dCTP濃度比值至關(guān)重要。我們?cè)谏弦徽n題中已發(fā)現(xiàn)，該比值過(guò)高會(huì)影響ASPE 引物有效延伸，過(guò)低則熒光信號(hào)弱，維持在3：1 可取得較好效果[11,15]。

方法學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果表明：本方法靈敏度高，最低檢測(cè)限達(dá)0.75ng；特異度強(qiáng)，設(shè)計(jì)的ASPE 引物探針與其他位點(diǎn)均無(wú)交叉反應(yīng)；準(zhǔn)確性高，25份樣本檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全一致，基本可滿足臨床需求。

本研究也有一定的局限性，本次研究只收集了115份臨床標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，屬小標(biāo)本研究事件，同時(shí)MFI的批內(nèi)批間CV值達(dá)26.3%和33.7%，課題組將繼續(xù)收集臨床標(biāo)本，對(duì)系統(tǒng)參數(shù)進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，以解決CV值偏高的問(wèn)題，進(jìn)一步在大樣本層面驗(yàn)證，以期臨床應(yīng)用。

綜上所述，本研究成功建立了液相芯片檢測(cè)系統(tǒng)，可高效便捷檢測(cè)7個(gè)2型糖尿病降糖藥相關(guān)藥物基因型，滿足臨床的需求，有望為臨床選擇適宜降糖藥，減少不良反應(yīng)，提高藥效提供實(shí)驗(yàn)室支持。