鐘宇蕭(綜述)， 蒿艷蓉(審校)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，來源于鼻咽部的上皮細胞，和其他上皮性頭頸部腫瘤起源于相似的細胞或組織譜系，易發(fā)生局部浸潤和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且惡性程度高。NPC發(fā)生與EB病毒(epstein-barrvirus,EBV)感染、腫瘤抑制因子失活、癌基因激活和環(huán)境等因素有關(guān)[1-2]，在我國廣東、廣西、福建，以及東南亞、北非地區(qū)高發(fā)，多見于男性華人，男女發(fā)病率約為2.5∶1，年發(fā)病率近千分之三，具有家族聚集性特點，高發(fā)的家族移居后發(fā)病率也會高于當?shù)鼐用?。而且NPC具有雙峰年齡分布特點：一是在50～60歲左右，二是小高峰為青少年和年輕人[3]。根據(jù)目前世界衛(wèi)生組織的病理分類，NPC分為角化鱗狀細胞癌和非角化癌。后者進一步細分為非角化分化癌和非角化未分化癌。隨著影像學技術(shù)的進步，雖然同步調(diào)強放療加化療、手術(shù)以及其他輔助性治療，使得患者局部癥狀的控制率有所提高，尤其是新型放射技術(shù)或設(shè)備的改進，局部控制率可達到90%左右，但是在針對遠處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)治療的效果還存在一定的局限性。從機制上講，NPC發(fā)展過程中，腫瘤細胞不斷向周圍環(huán)境釋放外泌體，外泌體濃度越高，代謝和生理活動越活躍，惡性程度越高。本文對外泌體主要通過調(diào)節(jié)細胞過程在細胞-細胞通信中發(fā)揮重要作用進行綜述。

1 NPC微環(huán)境外泌體的形成

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment,TME)由腫瘤基質(zhì)、周圍血管和腫瘤細胞本身組成，包括周圍的免疫細胞、血管、細胞外基質(zhì)、成纖維細胞、淋巴細胞、骨髓源性炎癥細胞和信號分子[4]。NPC微環(huán)境中細胞間的通訊，通過直接的細胞-細胞接觸或通過轉(zhuǎn)移分泌的細胞因子介導，是維持多細胞生物細胞功能和組織穩(wěn)態(tài)所必需的因素。細胞相互作用的破壞會導致正常細胞-細胞通訊的中斷，從而促進NPC的發(fā)生[5-6]。通常細胞會釋放各種類型的囊泡來維持正常的功能，如來自內(nèi)小體和質(zhì)膜的外小體和微囊泡[7]。外小體是直徑約40～150 nm由質(zhì)膜直接向外出芽形成的水泡結(jié)構(gòu)，它包含轉(zhuǎn)錄因子、細胞表面受體、胞漿和核蛋白、miRNA和mRNA。質(zhì)膜的內(nèi)吞導致細胞內(nèi)形成內(nèi)吞小泡，進而相互融合形成內(nèi)小體，隨著內(nèi)小體的生長和成熟，形成多囊體。多囊體可經(jīng)內(nèi)溶酶體降解回收，也可被外溶酶體釋放到細胞表面。當多囊體與質(zhì)膜融合時其腔內(nèi)囊泡釋放到細胞外，從而形成外泌體[8]。NPC微環(huán)境外泌體不僅包括EBV相關(guān)外泌體、NPC衍生外泌體、間充質(zhì)干細胞-衍生外泌體和人類EBV轉(zhuǎn)化淋巴母細胞衍生外泌體，它還含有許多來自樹突狀細胞和骨髓祖細胞的外泌體等[9]，這些外泌體攜帶的大量功能性蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA、DNA片段等多種生物活性物質(zhì)。

2 NPC微環(huán)境外泌體的遷移、侵襲、凋亡作用

上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-to-mesenchymal trasition,EMT)是促進細胞運動和啟動轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。Guo等[10]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞來源p53激活C-C基序趨化因子配體2(CCL2)的轉(zhuǎn)錄，CCL2水平升高后通過chemokine receptor 2(CCR2)促進轉(zhuǎn)移和EMT。同樣，NPC衍生外泌體潛伏膜蛋白2(latent membrane protein 2，LMP2)通過誘導PI3K/AKT/mTOR通路促進NPC中的EMT磷酸化為4EBP1，激活的4EBP1-eIF4E軸可以上調(diào)表達轉(zhuǎn)移的腫瘤抗原1(metastatic tumor antigen 1,MTA1)，并且通過Wnt1途徑和激活β-catenin來促進EMT[9，11]，還可以通過ERK1/2通路促進轉(zhuǎn)錄因子Fra-1的產(chǎn)生，LMP2A上調(diào)鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SPHK1)，可產(chǎn)生鞘氨醇-1磷酸(S1P)激活A(yù)KT，從而促進EBV相關(guān)的NPC細胞遷移[9，11]。Wasil等[12]證明LMP1可上調(diào)局灶性黏附(FA)復(fù)合物的形成，促進上皮細胞遷移。LMP1還可以下調(diào)腫瘤抑制因子miR-204，從而增強Cdc42介導細胞侵襲特性的活性，如焦點復(fù)合物的形成、整合素的定位和MMP的表達[13]。此外，癌癥相關(guān)成纖維細胞(cancer-related fibroblasts,CAFs)對癌癥的發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。Zhu等[14]證實了環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase 2，COX-2)在原發(fā)性NPC組織中的低表達，但在CAFs轉(zhuǎn)移部位高表達，COX-2在成纖維細胞中的高表達通過COX-2-PGE2-TNF-α軸增強NPC的遷移特性。Wu等[15]研究發(fā)現(xiàn)EBV感染的NPC微環(huán)境中EBV相關(guān)外泌體LMP1通過NF-κB/p65信號通路激活正常成纖維細胞(normal fibroblasts,NFs)成為CAFs，而LMP1已被證明通過依賴ERK-MAPK通路的機制在上皮細胞中誘導EMT，但抑制TGF-β信號對逆轉(zhuǎn)EMT表型沒有影響[16]。我們可以推測LMP1可以通過上皮細胞中的ERK-MAPK信號直接驅(qū)動EMT，或者間接通過CAFs的招募和激活，刺激它們釋放的TGF-β以旁分泌的方式作用于TME中的NPC細胞，或者二者是協(xié)同作用?？梢姡琋PC微環(huán)境的外泌體通過不同的信號通路誘導EMT或CAFs，對調(diào)控TME發(fā)揮了重要作用。CAFs是預(yù)后較差的一個突出特征，因此，外泌體在CAFs中的作用，在將來有望幫助腫瘤的診斷分期、治療效果評估以及成為監(jiān)測腫瘤進展的標志物。

3 NPC微環(huán)境外泌體的促血管生成

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和擴散取決于新生的血管，這些血管為維持腫瘤生長提供了所需的營養(yǎng)、生長因子和氧氣。腫瘤在進展的不同階段，腫瘤血管生成涉及復(fù)雜的內(nèi)皮細胞活動的編排，包括增殖、遷移、入侵、黏附和分化[17]。Lu等[18]用遷移法、管形成法和基質(zhì)凝膠塞法分別評價了內(nèi)皮細胞相關(guān)外泌體miR-9對人臍靜脈內(nèi)皮細胞系(human umbilical vein endothelial cell line，HUVECs)在體內(nèi)和體外細胞遷移和管形成關(guān)系，研究數(shù)據(jù)表明了外泌體miR-9通過靶向介導MDK和調(diào)節(jié)PDK1/AKT通路抑制內(nèi)皮細胞生成，從而抑制血管形成，然而miR-9過表達則通過AMPK信號通路促進成骨細胞分化和血管生成。結(jié)果揭示miR-9可以通過多條信號通路介導內(nèi)皮細胞的生成，進而影響血管形成。Bao等[19]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞和高血管化組織中富集的miR-23a-27a-24-2簇成員通過抑制miR-23/27靶向誘導Sprouty 2和Sema 6A蛋白來抑制發(fā)芽血管生成。在此基礎(chǔ)上，他們還發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-23a可促進細胞生長、遷移和內(nèi)皮細胞的管形成。我們可以進一步猜測，是否外泌體miR-23a以旁分泌的機制，從NPC細胞轉(zhuǎn)運到內(nèi)皮細胞后通過直接靶向睪丸特異性基因抗原(testis-specific gene antigen，TSGA10)加速鄰近腫瘤內(nèi)膜的血管生成。BMP和激活素受體膜結(jié)合抑制劑(BAMBI)，作為TGF-β typeⅠ受體家族成員的競爭偽受體，在腫瘤的發(fā)生和血管生成中起著重要的作用。Duan等[20]的研究表明，來自NPC細胞的外泌體miR-17-5p通過靶向作用于BAMBI和調(diào)節(jié)AKT/VEGF-A信號促進血管生成。此外，TME外泌體還通過VEGF、EGFR和STAT3介導的途徑，以多種方式調(diào)節(jié)細胞生長、遷移和血管生成[17，21]。綜上所述，NPC微環(huán)境外泌體在介導血管生成中起著重要作用。

4 NPC微環(huán)境外泌體參與免疫作用

NPC微環(huán)境中存在許多免疫抑制因子，通過募集免疫抑制細胞抑制局部免疫反應(yīng)，使得原本起保護作用的免疫反應(yīng)抑制腫瘤生長失敗，甚至導致癌基因的產(chǎn)生。然而，外泌體通過免疫細胞和癌細胞之間的通訊，參與微環(huán)境的免疫機制，對免疫監(jiān)測、免疫抑制和免疫逃逸起著關(guān)鍵性作用[22]。一方面，NPC細胞分泌的外泌體程序性死亡配體1(PD-L1)可能參與細胞因子和趨化因子等免疫介質(zhì)的調(diào)節(jié)，通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)通訊抑制微環(huán)境中免疫反應(yīng)[5，23]。活化基質(zhì)、抗炎M2巨噬細胞等是免疫衰竭的特征，可激活WNT/TGF-β信號通路，促進TGF-β在衰竭亞型中顯著富集，從而抑制宿主的免疫應(yīng)答[24]。研究[25]表示PD1/PD-L1過表達，通過轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta,TGF-β1)去掉DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT 1)，以啟動子的去甲基化或以依賴TNF-α的方式激活I(lǐng)KKE/NF-κB信號通路，從而促進TME中的免疫逃逸。另一方面NPC衍生外泌體和間充質(zhì)干細胞衍生外泌體(IEXs)已被證明通過轉(zhuǎn)移抗原來激活CD4T細胞和CD8T細胞，從而增強抗腫瘤反應(yīng)并抑制腫瘤進展[23]。同樣，微環(huán)境中EB病毒核抗原-1(EBV encoded nuclear antigen 1,EBNA-1)蛋白，通過產(chǎn)生IgA抗體來增強對EBNA-1的體液免疫反應(yīng)[26]。NOPC來源的外泌體白介素-18(interleukin-18,IL-18)和CXC趨化因子配體10(CXCL10)可能誘導趨化因子受體3(CXCR3)陽性T細胞產(chǎn)生γ干擾素(interleukin-γ,IFN-γ)，IFN-γ能形成積極的調(diào)節(jié)回路促進惡性上皮細胞產(chǎn)生CXCL10，導致炎癥反應(yīng)和白細胞浸潤。此外，LMP1還可上調(diào)IL-18，這導致IL-18、IL-6和血清粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)進入TME增多，從而抑制TME中的免疫監(jiān)測[11]。由此可見，微環(huán)境的免疫調(diào)節(jié)關(guān)系錯綜復(fù)雜，提示了僅靠單一靶點很難掌握免疫調(diào)節(jié)機制，要不斷發(fā)掘新的靶點及代償通路，微環(huán)境中有更多外泌體有望成為免疫治療的新靶點。

5 NPC缺氧微環(huán)境中的外泌體

腫瘤細胞的增殖使局部基底膜受損，TME遭受缺氧和破壞。TME缺氧是觸發(fā)腫瘤血管生成并激活缺氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)表達的主要力量[17]。HIF-1是一種轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞代謝和生理過程的各個方面，包括癌癥的發(fā)生、發(fā)展。由于骨髓祖細胞來源外泌體HIF-1a mRNA的表達整合多種病毒致癌的生物途徑，使大多數(shù)致癌病毒能夠穩(wěn)定或增強血管生成因子HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性。缺氧微環(huán)境中，隨著HIF-1a的積累，激活許多缺氧條件下的靶基因，如促血管生成因子和促生長因子、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白以及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)。由于HIF-1a在誘導機制中的重要性，使得MMP-13過度表達，從而誘導NPCEMT和腫瘤侵襲[27]。Li等[28]用Hre2構(gòu)建了4個質(zhì)粒，證明了NPC衍生外泌體葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白-78(glucose-regulated protein 78，GRP78)嵌合啟動子調(diào)控融合基因TK/VP3，表達的TK和VP3，在葡萄糖缺乏或缺氧條件下能顯著抑制NPC細胞的增殖，促進NPC細胞的凋亡。同時證實了miR-519可以直接結(jié)合HIF-1a，并顯著抑制其表達，若HIF-1a過強可反饋性抑制miR-519進而抑制NPC細胞進展。此外，LMP1在這些細胞成為低氧甚至缺氧微環(huán)境下的高級腫瘤細胞之前，激活具有腫瘤干細胞或祖細胞樣特性的細胞的低氧信號通路，這有助于維持腫瘤干細胞在NPC早期階段的發(fā)育[29]。綜上所述，缺氧是TME重要的組成因素，癌細胞可以通過多種細胞機制適應(yīng)所處的缺氧環(huán)境，同時TME外泌體在通過不同的信號通路促進或抑制腫瘤細胞的適應(yīng)性方面發(fā)揮了重要作用。

6 NPC微環(huán)境外泌體在臨床中的應(yīng)用

在NPC的進展中，腫瘤細胞不斷向周圍環(huán)境釋放外泌體。外泌體可以將生物信號從腫瘤傳遞到遠處的組織和器官，甚至進入血液循環(huán)中遍布全身。因此，外泌體可以作為靶向給藥載體，在供體細胞和受體細胞之間的細胞貨物的載體中起內(nèi)源性作用，以及在激發(fā)生物反應(yīng)中起作用。外泌體在治療中的使用包括抗腫瘤藥物的藥物傳遞、免疫調(diào)節(jié)、去除體液中腫瘤來源的外泌體、調(diào)節(jié)外泌體含量以防止腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[5，30]。外泌體中嵌有不同類型的病毒成分，如LMP1、LMP2A、BAMHI-a向右結(jié)構(gòu)1(Bam-HIA rightward frame 1,BARF1)和EBV核酸(DNA、mRNA和miRNA)，這些EBV相關(guān)外泌體靶點可以作為NPC診斷和預(yù)后指標，也可以作為不同類型EBV相關(guān)癌和疾病的治療靶點[31-32]。而且研究[33]發(fā)現(xiàn)，環(huán)親素A(cyclophilin A,CYPA)不僅可以被排入外周血，還可以被輸送并富集在血清外泌體中，外泌體CYPA和EBV-VCA-IgA的結(jié)合可以提高診斷的準確性，尤其是當EBV-VCA-IgA為陰性的時候。該研究提示，循環(huán)外泌體CYPA是一種新的提示NPC不良預(yù)后的生物標志物。而且還有研究[9]提示，NPC微環(huán)境中外泌體EBV-BART1-miRNAs在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用，可作為無創(chuàng)生物標志物用于NPC患者的早期檢測、診斷和治療監(jiān)測。此外，RAB27A通過調(diào)節(jié)外泌體介導的侵襲性，從而刺激癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移，表明RAB27A是發(fā)病機制的重要調(diào)節(jié)因子，因此它既是幾種類型癌癥的關(guān)鍵預(yù)后指標，也是治療靶點[34]。綜上所述，雖然微環(huán)境中外泌體在腫瘤的治療、診斷及預(yù)后中發(fā)揮重要作用，但由于NPC極易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，使得其在臨床方面的應(yīng)用尚處于初級階段。因此微環(huán)境中外泌體有著巨大研究潛力和意義。

7 結(jié)語

我們探索了NPC微環(huán)境的外泌體通過多種途徑參與NPC細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲和凋亡，外泌體有望成為評估腫瘤進展的一項重要的生物學指標。外泌體通過不同信號通路調(diào)節(jié)血管生成，例如外泌體miR-9通過靶向誘導MDK和調(diào)節(jié)PDK1介導的AKT通路進而抑制內(nèi)皮細胞，從而抑制血管形成，使我們有望找到調(diào)控血管生成起主要作用的關(guān)鍵突變，有可能找到抗腫瘤血管生成的新的治療靶點。此外，通過外泌體在TME中的免疫檢測、免疫調(diào)節(jié)及免疫逃逸等機制，有可能為腫瘤的免疫治療提供新的治療思路。盡管現(xiàn)在外泌體的研究進展較大，但總體理解和認識仍不夠全面。在TME中如何識別不同活性細胞來源的外泌體，以及如何通過外泌體所攜帶的多種生物活性成分，如蛋白質(zhì)、miRNA、DNA等，進一步發(fā)現(xiàn)、驗證、提取出更多重要的外泌體是不小的挑戰(zhàn)。目前，關(guān)于NPC微環(huán)境中的外泌體在臨床的診斷工作中運用研究并不是很多，外泌體在NPC診斷中的潛力還沒有被挖掘出來。我們要挖掘更多的外泌體，并進一步闡明它們的功能作用和臨床意義，探討其在NPC患者的治療中所起的作用。