石磊泰 綜述，李玉華 審校

中國食品藥品檢定研究院，北京 102629

狂犬病病毒CTN-1 株由中國藥品生物制品檢定所（現(xiàn)中國食品藥品檢定研究院）分離并保存。CTN-1 株是1956 年從山東省淄博市1 名死于狂犬病的患者腦組織中提取的，當時該病毒被命名為CTN-S1 株，經(jīng)小鼠腦內(nèi)連續(xù)傳代56 代后變?yōu)楣潭ǘ?，被命名為CTN-M 株，后續(xù)在KMB-17 細胞上連續(xù)傳代50 代適應為CTN-1 株。CTN-1 株經(jīng)全面檢定后未發(fā)現(xiàn)被外源病毒污染，抗原性與固定毒一致［1-3］。

本文對狂犬病病毒CTN-1 株在狂犬病疫苗中應用的研究進展作一綜述。

1 細胞傳代適應性

1. 1 在Vero 細胞等傳代細胞上的適應性 李宏玲等［4］發(fā)現(xiàn)，用Vero 細胞培養(yǎng)CTN 病毒時，CTN-42代病毒和CTN-103 代病毒的滴度在第8 代后顯著增加，在第17 代后保持高水平，其中CTN-42 株平均滴度達7.13 lgLD50／mL，CTN-103 株達6.6 lgLD50／mL，且兩株病毒增殖高峰均提前3 ～5 d，空斑形態(tài)大小也較適應前清晰，直徑增大至1. 0 ～1. 5 mm。表明CTN 株在Vero 細胞適應后可達到較高滴度，適用于疫苗生產(chǎn)。

董關(guān)木等［5］和王宏偉等［6］進一步證實，CTN-1株用Vero 細胞培養(yǎng)可快速適應，病毒滴度達7. 0 ～7. 5 lgLD50／ mL 以上，可多次收獲培養(yǎng)液；在5 ～20 代內(nèi)，病毒滴度均穩(wěn)定在7. 0 lgLD50／ mL 左右。后續(xù)董關(guān)木等［7］對CTN-1 株在Vero 細胞上的吸附及增殖特性進行了研究，結(jié)果表明，CTN-1 株對Vero細胞有較強的吸附作用，接觸后可大量吸附。MOI為0. 1 時，10 min 內(nèi)細胞可吸附99%以上的病毒；MOI 為1. 0 時，上清液中有大量病毒無法吸附至細胞上，60 min 后，超過98%的病毒可被吸附。CTN-1株在Vero 細胞中的復制周期小于16 h。此外，細胞內(nèi)有相當高的傳染性病毒顆粒，其滴度同時高于細胞外，72 h 內(nèi)細胞內(nèi)外比例基本平衡。CTN-1 株的這一特性表明病毒培養(yǎng)至收獲的最佳周期為3 ～4 d，這樣當細胞感染時，死亡病毒較少，很容易一次達到最大感染量。

郭金華等［8］觀察了狂犬病病毒CTN-1 株在Vero細胞中的生長和感染特征。通過分離和混合的方法確定了Vero 細胞的生長以及細胞內(nèi)外的病毒含量。結(jié)果表明，Vero 細胞的形態(tài)隨病毒接種時間的變化而變化，不同接種方法的病毒滴度無明顯差異。4 ～9 d 病毒滴度最高，第4 天細胞病毒感染率超過80%，第10 天后開始下降，并在第15 天達到最低點。確定了最佳收獲時間為4 ～9 d，MOI 為0. 01 ～0. 10。

孫怡等［9］比較了3 種傳代細胞系（Vero、BHK-21 和MDCK 細胞）對狂犬病病毒CTN-1 株的敏感性。研究采用混種的方法，將CTN-1 株分別接種至上述3 種不同來源的連續(xù)傳代細胞系，在不同時間觀察3 種細胞的病變情況，同時應用快速免疫熒光灶抑制試驗（rapid fluorescence focus inhibition test，RFFIT）和ELISA 法檢測病毒滴度和抗原含量，分析不同來源細胞對CTN-1 株的敏感性。結(jié)果顯示，Vero細胞培養(yǎng)的CTN-1 株病毒滴度在第8 天達到高峰，為7. 80 lgFFD50／ mL，BHK-21 細胞在第6 天達到高峰，為7. 30 lgFFD50／ mL，而MDCK 細胞在第6 天僅為5. 55 lgFFD50／ mL。BHK-21 細胞培養(yǎng)的CTN-1株抗原含量值在各代次均高于Vero 和MDCK 細胞。表明Vero 和BHK-21 細胞對狂犬病病毒CTN-1 株的敏感性高于MDCK 細胞，且BHK-21 細胞產(chǎn)毒高峰較Vero 細胞提前。

孫燕等［10］初步建立了無血清培養(yǎng)Vero 細胞制備狂犬病病毒的方法，為大規(guī)模制備無血清狂犬病疫苗奠定了基礎。研究采用無血清培養(yǎng)基（VP-SFM）和含5%牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero 細胞，制備狂犬病病毒CTN-1V 株，比較無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的不同代次Vero 細胞及含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的Vero細胞制備的病毒的滴度和效價。向250 mL 搖瓶中加入2 g／L 微載體cytodex-1，加入Vero 細胞后37 ℃培養(yǎng)3 d，按MOI = 0. 02 感染狂犬病病毒CTN-1V株，檢測病毒收獲液的病毒滴度及效力，每日鏡下觀察細胞生長狀況，計算比細胞生長率。結(jié)果顯示，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的Vero 細胞制備的病毒的滴度及效價差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0. 05）；在無血清和含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的Vero 細胞制備的病毒的效價差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。無血清培養(yǎng)Vero細胞制備的病毒的效果優(yōu)于含血清培養(yǎng)基（P ＜0.05）。用攪拌瓶微載體培養(yǎng)Vero 細胞制備狂犬病病毒，細胞黏附均勻，生長良好。收獲病毒液的平均滴度為6. 50 lgFFU ／ mL，平均效力為6. 77 IU ／ mL。

1. 2 在雞胚細胞上的適應性 GUO 等［11］、李慧等［12］、ZHU 等［13］在研究CTN-1 株適應雞胚細胞方面取得了進展，并研究了CTN-1 株在雞胚細胞馴化過程中的特性。利用RT-PCR 反應擴增CTN-1 株19 個代次的G 蛋白基因，獲得cDNA 進行序列測定，并采用免疫熒光法測定各代次毒株在細胞中的滴度。序列測定結(jié)果顯示，CTN-1 株在雞胚細胞馴化過程中G蛋白基因序列發(fā)生不同程度變異且逐步積累，從第30 代開始，趨于穩(wěn)定。與CTN-1 株相比，雞胚細胞馴化株在G 蛋白的第147、333、389、421 和485 位氨基酸發(fā)生了突變。與此對應，CTN-1 株雞胚細胞馴化株滴度逐漸趨于穩(wěn)定，第33 ～58 代滴度維持在7. 0 ～7. 5 lgFFU ／ mL。G 蛋白同源性分析結(jié)果表明，CTN-1 株雞胚細胞馴化株與我國近期不同區(qū)域分離得到的街毒株具有較高同源性，其G 蛋白氨基酸同源性為89. 3% ～99%。CTN-1 株在雞胚細胞馴化過程中G 蛋白基因發(fā)生穩(wěn)定變異，滴度在傳代后33 ～58 代達到較高水平，穩(wěn)定性較好。將CTN-1株在雞胚細胞的適應株命名為CTNCEC25 株。

王春華等［14］證實CTNCEC25 株是高度減毒、不易返祖的弱毒株，其在雞胚細胞上可穩(wěn)定、快速增殖，病毒滴度高（＞7. 0 lgFFU ／ mL），是安全性較高的狂犬病疫苗候選毒株。研究狂犬病病毒CTNCEC25株的增殖能力、病毒感染力及致病力等表型特征，為將該毒株應用于疫苗生產(chǎn)提供了參考。將CTNCEC25株及其母株CTN-1 株分別接種Vero、原代雞胚成纖維細胞（CEC 細胞）和小鼠神經(jīng)瘤母細胞（N2a 細胞），觀察細胞病變及復制規(guī)律；以腦內(nèi)注射的方式接種動物，觀察其對乳鼠、小鼠、豚鼠及家兔等動物的致病力；同時還將CTNCEC25 株在CEC 細胞上連續(xù)傳20 代，在乳鼠腦內(nèi)傳3 代，觀察其增殖能力、病毒感染力及致病力。結(jié)果表明，與母株CTN-1 株相比，CTNCEC25 株在Vero 和N2a 細胞上的增殖無顯著差異，但在CEC 細胞上有明顯優(yōu)勢，72 h 滴度可達7. 5 ～7. 6 lgFFU ／ mL，而CTN-1 株滴度僅為5. 8 lgFFU ／ mL；此外CTNCEC25 株在N2a、Vero 及CEC 細胞上均可產(chǎn)生明顯的細胞病變。腦內(nèi)致病力結(jié)果顯示，CTNCEC25 株雖然對1 ～3 日齡乳鼠仍有較強腦內(nèi)致病性，但對成年小鼠腦內(nèi)致病力大大減弱，對豚鼠和家兔不致病。經(jīng)細胞和乳鼠腦內(nèi)連續(xù)傳代，CTNCEC25 株在CEC 細胞上增殖穩(wěn)定，其減弱的毒力并未回升，無弱毒返祖現(xiàn)象。

郭采平等［15］對CTNCEC25 株在CEC 細胞上的培養(yǎng)工藝進行了研究，以M199 為基礎培養(yǎng)基，分別加入人血白蛋白、胎牛血清及HEPES 緩沖液，并均加入碳酸氫鈉，配制培養(yǎng)基M1、M2 和M3。將馴化獲得的CTNCEC25 株按1 ∶5 000 的比例接種至CEC細胞懸液中，在不同培養(yǎng)條件下，初步確定培養(yǎng)基配方、溫度、MOI 和時間4 大工藝參數(shù)范圍，再以正交試驗確定上述條件的最佳組合。單因素試驗初步確定的工藝參數(shù)：采用M2 或M3，培養(yǎng)溫度33 ～36 ℃，MOI=0.01 ～0.001 FFU／細胞，培養(yǎng)時間72 ～120 h，可獲得較高的病毒滴度（7. 0 lgFFU ／ mL 以上）。正交試驗確定的最佳工藝條件：采用M3，培養(yǎng)溫度33 ℃，MOI = 0. 01 FFU ／ 細胞，培養(yǎng)時間120 h，獲得的病毒滴度達7. 5 lgFFU ／ mL。優(yōu)化了CEC 細胞培養(yǎng)狂犬病病毒的工藝，CTNCEC25 株的病毒滴度由6. 0 lgFFU ／ mL 左右提高至7. 0 lgFFU ／ mL 以上，為獲得理想疫苗抗原量積累了數(shù)據(jù)。

1. 3 在二倍體細胞上的適應性 毛子安等［16］的研究顯示，將狂犬病病毒固定毒株CTN-1 連續(xù)在人二倍體細胞（KMB17）中傳代，并以終末稀釋法篩選出滴度較高的病毒，從而獲得適應于人二倍體細胞（KMB17）并具有良好免疫原性和傳代穩(wěn)定性的狂犬病病毒株，培育出可在人二倍體細胞（KMB17）高效增殖的狂犬病疫苗毒種（CTN-DK 株）。用該毒種生產(chǎn)人二倍體細胞（KMB17）狂犬病疫苗可有效避免當前國內(nèi)使用的疫苗中異種DNA 殘留引起的風險，將進一步提高我國狂犬病疫苗的安全性及實用性，具有重大的社會效益和經(jīng)濟效益。

何麗芳等［17］、MA 等［18］、徐道俊等［19］用狂犬病病毒固定毒CTN-1V 株經(jīng)昆明鼠腦內(nèi)傳代后的病毒接種人胚肺二倍體細胞Walvax-2，連續(xù)傳代后檢測各代病毒的滴度及免疫原性。結(jié)果顯示，CTN-1V株能較好地適應Walvax-2 細胞，通過連續(xù)帶毒傳代至第7 代，病毒滴度可達6. 78 lgLD50／ mL，第10 ～15 代內(nèi)滴度可以維持在7.0 lgLD50／mL 以上，第15 ～30 代滴度穩(wěn)定在7. 0 lgLD50／ mL 左右。以15 代適應毒株CTN-1V-HDC P15 制備的疫苗原液，各項指標均符合《中國藥典》三部（2010 版）通用要求，疫苗效力在6. 0 IU ／ 劑以上。用0. 05 MOI 接種病毒，采用的人二倍體細胞量≥2 × 108個，37 ℃懸浮混合吸附30 min，用DMEM + 0. 3%人血白蛋白作為病毒維持液（pH 7. 8 ～8. 0），換液3 d 后開始收獲病毒液，之后再進行5 ～7 d 病毒液的收獲，經(jīng)動物法和細胞法檢測收獲液病毒滴度。結(jié)果顯示，3 次收獲液病毒滴度均＞7. 0 lgLD50／ mL。建立了穩(wěn)定的狂犬病病毒株CTN-1V 在Walvax-2 細胞上的病毒收獲液制備工藝。Walvax-2 細胞傳代適應狂犬病病毒固定株CTN-1V-HDC，可用于人用狂犬病疫苗的生產(chǎn)開發(fā)。

崔棟等［20］一項涉及微生物及生物制藥領(lǐng)域的研究中，將狂犬病病毒株CTN-1V 在二倍體細胞MRC-5 的適應株命名為SNK-CTN 株。該病毒株通過以下方法制備：取MRC-5 細胞復蘇培養(yǎng)3 d 成單層細胞后，用0. 25%胰酶消化分散成均勻細胞，按0. 01 ～1. 0 MOI 接種狂犬病病毒CTN-1V5 株懸液，37 ℃培養(yǎng)2 ～3 d；更換為含2% ～4%牛血清的維持液，33 ～35 ℃培養(yǎng)3 ～5 d；收獲病毒液，-70 ℃凍存，制備成病毒懸液；用上述方法連續(xù)在MRC-5 細胞上傳30 ～32 代。

1. 4 在原代地鼠腎細胞上的適應性 早在2002 年，張玉慧等［21］曾經(jīng)嘗試將CTN-1 株在原代地鼠腎細胞（PHKC）上傳代適應，經(jīng)10 多代適應性傳代后，病毒滴度達7. 0 lgLD50／ mL，并應用適應株（CTNLS-HK）細胞毒種制備了3 批疫苗，效力為6. 11 ～6. 55 IU ／ mL。

2 基因特性

2. 1 糖蛋白（G）和核蛋白（N）的基因特性 狂犬病病毒糖蛋白（G）是決定抗原性、組織嗜性及毒力的最重要部分［22］。董關(guān)木等［5］完成CTN-1 株在Vero細胞上的適應性傳代后（即CTN-1V），吳小紅等［23］在2003 年隨即開展了CTN-1 株糖蛋白測序工作，利用RT-PCR 反應從感染CTN-1V 的Vero 細胞中獲得糖蛋白全長cDNA 片段，并克隆至PCR2. 1 載體后進行序列測定。結(jié)果顯示，CTN-1V 株糖蛋白cDNA 序列長度為1 575 個核苷酸，編碼524 個氨基酸。與國內(nèi)外已測定的狂犬病病毒糖蛋白序列，如aG、CGX89-1、SBD 07、CVS、HEP-Flury、N. HL、ERA、PV、RC-HL、SAD B19、Nisss higah aam 和Vnukovo-32，進行同源性比較，核苷酸同源性為80. 8% ～92. 4%，氨基酸同源性為82. 9% ～93. 3%。其中，CTN-1V 糖蛋白與國內(nèi)分離自廣西的街毒株CGX89-1、分離自上海的街毒株SBD07 的氨基酸同源性高達85. 5% ～93. 3%，提示CTN-1V 株與國內(nèi)流行株的基因結(jié)構(gòu)一致，可預測CTN-1 株狂犬病疫苗對國內(nèi)街毒株具有較好的保護作用。

明平剛等［24］將CTN-1-V5 株（Vero 細胞適應株第5 代）在鼠腦內(nèi)連續(xù)傳代至35 代，選取CTN-1-V7、CTN-1-V28 和CTN-1-V35 共3 個代次的毒株進行糖蛋白序列測定。結(jié)果表明，3 代CTN-1-V 株與我國目前使用的疫苗株CTN-1-V5 的核苷酸序列及相應的氨基酸序列同源性均較高，親緣關(guān)系均較近，表明CTN-1-V 株盡管傳代次數(shù)不同、傳代方式不同，但仍然保持相當?shù)姆€(wěn)定性；在進化樹上，3 個代次CTN-1-V 非常接近，肯定了其作為狂犬病病毒疫苗株的有效性。

而孟勝利等［25］在明平剛等［24］研究的基礎上挑選CTN-1-7、CTN-1-26、CTN-1-27、C TN-1-28、CTN-1-29、CTN-1-30、CTN-1-33 和CTN-1-35 共8 個代次的毒株進行核蛋白和糖蛋白的序列測定。結(jié)果顯示，CTN-1 株8 個代次之間的核苷酸序列幾乎完全相同。CTN-1 株在傳代過程中N 和G 基因變異小，與中國流行的代表性街毒株的同源性高于其他疫苗株。與我國分離的街毒株相比，核苷酸的同源性分別為84. 2% ～95 0%和80. 4% ～94. 3%，氨基酸同源性分別為92. 1% ～99. 6%和88. 7% ～98. 5%。

2. 2 全基因序列的基因特性 2010 年，吳小紅等［23］的觀點得到了另一項研究的證實。在該項研究中，石磊泰等［26］首次對我國狂犬病疫苗生產(chǎn)株CTN-1進行了全序列測定及分析。利用RT-PCR 方法分段擴增CTN-1 株全基因組序列，隨后進行測序，用Meg-Align 軟件比較CTN-1 株全序列與國內(nèi)外狂犬病病毒疫苗株、街毒株全序列的同源性，再以糖蛋白G 基因為模板，用ClustalX 和MEGA4 軟件進行系統(tǒng)進化分析。結(jié)果顯示，CTN-1 株全序列長度為11 925 nt（GenBank 登錄號：FJ959397），為基因Ⅰ型，與國內(nèi)外狂犬病疫苗株、街毒株全序列之間的同源性為81. 5% ～93. 4%，與美國蝙蝠分離株SHBRV18 的同源性最低，僅為81. 5%，與中國新分離的野毒株HN10 的同源性最高，為93. 4%。系統(tǒng)進化分析顯示，CTN-1 株與國內(nèi)大多數(shù)街毒株聚類于同一組內(nèi)，而我國另一疫苗株aG 株與Flury、PM、PV、ERA、RC2HL 等疫苗株和少數(shù)中國街毒株聚類于另一組內(nèi)。G 基因氨基酸對比顯示，CTN-1 株與國內(nèi)大多數(shù)街毒株的同源性高于其他疫苗株。表明CTN-1 株較其他疫苗株更適合用于預防我國的狂犬病，這一結(jié)論為CTN-1株在我國實際應用中的優(yōu)勢奠定了理論基礎。需要注意的是，該結(jié)論在2020 年被印度的T. Nagarajan 和美國的C. E. Rupprecht 曲解和錯誤引用，因為他們否認同源性分析用于說明毒株親緣關(guān)系的作用［27］。

2018 年的另一篇報道證實了石磊泰等［26］的研究結(jié)論。盧學新等［28］的這篇報道涉及了CTN-1 株的研究，他們通過RT-PCR 法獲取CTN-1 株主種子批的全基因組序列，與國內(nèi)分離的全基因組序列進行比對，并對狂犬病病毒主要抗原進行比對分析，結(jié)果顯示，CTN-1 株與我國街毒株的親緣關(guān)系更近，符合作為疫苗候選株的要求。

3 免疫保護

3. 1 暴露前免疫保護 CTN-1 株用于人體的免疫原性的報道較早的文獻可能是于偉等［29］2001 年的一項研究，他們以Vero 細胞為基質(zhì)，以CTN-1V10 為生產(chǎn)毒株，以＜150 代Vero 細胞為培養(yǎng)基質(zhì)，采用轉(zhuǎn)瓶旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，按不同時間收獲病毒液，經(jīng)澄清、濃縮、純化、滅活制成精制Vero 細胞狂犬病疫苗。從以此工藝制備的疫苗中選取1 批為免疫學效果觀察的受試疫苗。按暴露后免疫程序接種63 人，其中受試疫苗接種33 人，法國維爾博狂犬病疫苗接種30 人，觀察不良反應并檢測中和抗體。結(jié)果顯示，新研制的精制Vero 細胞狂犬病疫苗各項指標完全符合WHO的相關(guān)質(zhì)量要求。兩種疫苗全程免疫后中和抗體陽轉(zhuǎn)率均為100%，中和抗體受試組為11. 94 IU ／ mL，維爾博疫苗對照組為11. 69 IU ／ mL。表明CTN-1精制Vero 細胞人用狂犬病疫苗不但制造工藝合理，且副反應輕微，免疫原性良好。

錢浩等［30］的一項研究也觀察到了類似的現(xiàn)象，他們選擇20 例健康受試者接種應用CTN-1V 株毒種制備的狂犬病疫苗，觀察接種者的不良反應并檢測中和抗體。結(jié)果顯示，接種者不良反應率為35%（7／20），中和抗體陽轉(zhuǎn)率為100%，免疫后14 d 中和抗體水平平均為13.08 IU／ mL（5.83 ～22.16 IU／mL）。表明CTN-1V 株毒種不良反應輕微且免疫原性良好，可在短時間產(chǎn)生較高水平的中和抗體。

陳偉等［31］為了觀察人用凍干狂犬病疫苗（Vero細胞／ CTN 疫苗株）的安全性、免疫原性和抗體持久性，進行了大規(guī)模人群的研究。將450 名健康志愿者隨機分為2 組，300 人（試驗組）接種人用凍干狂犬病疫苗，150 人（對照組）接種進口凍干狂犬病純化疫苗。按照0、3、7、14、28 d 免疫程序，觀察每針次接種后局部和全身反應，采用RFFIT 試驗檢測0、3、7、14、28 d 血清中和抗體水平（GMT）。初次免疫后365 d，采集試驗組血液樣本212 份，對照組血液樣本97 份；初次免疫后730 d，采集試驗組血液樣本176 份，對照組血液樣本80 份。結(jié)果顯示，接種者均未出現(xiàn)嚴重的局部或全身反應。初次免疫后3、7、14、28、365 和730 d，試驗組抗體陽轉(zhuǎn)率分別為2.35%、80. 78%、100. 00%、100. 00%、98. 58%和73. 30%，GMT 分別為0.12、1.01、9.83、12.61、3.68 和2.81IU／mL；對照組抗體陽轉(zhuǎn)率分別為4.00%、87.20%、100.00%、100. 00%、97. 94%和76. 25%，GMT 分別為0. 13、1. 18、10. 24、11. 61、4. 18 和1. 92 IU ／ ml。試驗組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0. 05）。表明人用凍干狂犬病疫苗（Vero 細胞／ CTN 疫苗株）具有良好的安全性、免疫原性和抗體持久性。

2017 年黃莉榮等［32］針對國內(nèi)一家即將上市銷售的、以CTN-1 株生產(chǎn)的凍干人用狂犬病疫苗（Vero細胞）進行了安全性和免疫原性考察。在廣西岑溪市和蒼梧縣共選擇1 200 名10 ～60 歲健康受試者。采用隨機、盲法、陽性對照試驗設計。將1 200 名受試者按1 ∶1 的比例隨機配對，接種試驗疫苗和對照疫苗（市場上同類產(chǎn)品）。按第0、3、7、14 和28 天的免疫程序，在初次接種疫苗后42 d 的隨訪期間觀察到全身和局部不良反應。初次接種后第14 和42 天采集血樣，采用RFFIT 試驗檢測狂犬病病毒中和抗體，計算抗體幾何平均濃度（GMC）。結(jié)果顯示，1 199名受試者完成了安全性觀察。試驗疫苗組（600 例）和對照疫苗組（599 例）全身反應發(fā)生率分別為12.33%和18. 03%（P ＜0. 05），常見癥狀為發(fā)熱（發(fā)生率分別為8. 00%和13. 19%），局部反應發(fā)生率分別為5. 33%和10. 52%（P ＜0. 05）。同時觀察了1 147 名受試者的免疫原性。初次免疫后，試驗疫苗組（571例）和對照疫苗組（576 例）抗體陽轉(zhuǎn)率在第14 天分別為100. 00%和99. 83%，第42 天均為100. 00%，差異均無統(tǒng)計學意義（P ＞0. 05）；第14 天抗體GMC分別為8. 94 和7. 96 IU ／ mL，第42 天分別為17. 26和15. 04 IU ／ mL，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0. 05）。表明凍干人用狂犬病疫苗（Vero 細胞／ CTN-1 株）具有良好的安全性及免疫原性。目前該疫苗已于2017年上市，2019 年的批簽發(fā)量為202. 4 萬支［33］。

2018 年黃騰等［34］進行了一項評價國產(chǎn)CTN-1V 株人用狂犬病疫苗（Vero 細胞）在10 ～60 歲健康受試者中的安全性及免疫原性的研究。他們使用了同類產(chǎn)品的隨機、盲目、并行控制設計。將廣西永?？h的900 名受試者隨機配對，以2 ∶1 的比例接種試驗疫苗和對照疫苗，觀察安全性。所有受試者均在初次免疫前以及免疫后14 和45 d 采集靜脈血，經(jīng)RFFIT 試驗檢測血清中抗狂犬病病毒的中和抗體效價，計算GMC。結(jié)果顯示，試驗組和對照組不良反應發(fā)生率分別為32. 33%和38. 67%（P ＜0. 05）。接種部位的局部反應主要為疼痛、發(fā)紅、腫脹和瘙癢，而全身反應主要為發(fā)燒、頭痛和疲勞，且大多數(shù)是輕度（1 級）。免疫后14 和45 d，試驗組狂犬病病毒中和抗體陽轉(zhuǎn)率均為100. 00%，GMC 分別為9. 96 和28. 83 IU ／ mL，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0. 05）。表明國產(chǎn)CTN-1V 株人用狂犬病疫苗（Vero 細胞）具有良好的安全性和免疫原性。目前該疫苗也于2017 年上市，2019 年的批簽發(fā)量為128. 3 萬支［32］。

3. 2 暴露后免疫保護 程滿榮等［35］在2008 年進行了關(guān)于CTN-1 株疫苗暴露后免疫的研究。他們用CTN-1 株疫苗免疫小鼠，用3 株具有代表性的街毒株CQ92、HN06、J 和標準攻擊毒株CVS 經(jīng)腦內(nèi)和肌肉攻擊，以未免疫小鼠的腦內(nèi)和肌肉攻擊為對照，觀察CTN-1 株疫苗的保護效果。結(jié)果顯示，原倍和5 倍稀釋的疫苗免疫的小鼠經(jīng)3 株街毒肌肉攻擊后，均獲得100%的保護，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0. 05）；原倍疫苗免疫的小鼠經(jīng)3 株街毒腦內(nèi)攻擊后，均獲得100%的保護，5 倍稀釋的疫苗免疫的小鼠對3 株街毒CQ92、HN06、J 的保護率分別為85%、75%和77. 8%，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）?；趧游飳嶒灁?shù)據(jù)得出CTN-1株疫苗總體上能有效預防我國目前狂犬病的流行。

4 結(jié) 語

1994年10月—2001年10月中國藥品生物制品檢定所（現(xiàn)中國食品藥品檢定研究院）董關(guān)木等［36］利用衛(wèi)生部科技貸款和自籌資金，將我國自行分離、減毒的狂犬病病毒CTN-1 株適應于Vero 細胞。該病毒在Vero 細胞中增殖迅速，病毒滴度可達8.0 lgLD50／mL以上，產(chǎn)量高且免疫原性好，該病毒已被國家食品藥品監(jiān)督管理局正式批準為人用狂犬病疫苗生產(chǎn)用毒種，并于2005 年被WHO 正式出版的文件（WHO TRS 941）確認為人用疫苗的毒種［37］。

狂犬病病毒CTN-1 株在我國分離、馴化、減毒、建立和應用，具有自主知識產(chǎn)權(quán)，并已完全適應Vero細胞，具有效價高、免疫原性好、濃縮倍數(shù)少、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，對人群有較好的保護作用。經(jīng)生物學、免疫學、免疫化學、分子生物學、基因測序和動物流行病學等綜合驗證，該毒株符合國家［38］和WHO［39］相關(guān)人類疫苗生產(chǎn)的要求和質(zhì)量標準，目前已實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

CTN-1 株完全適應于Vero 細胞后，2001 獲得新藥證書，目前已投入規(guī)?；a(chǎn)，先后有7 家公司實施產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。由于CTN-1 株與我國街毒株親緣關(guān)系更近，因此更適用于制備我國預防狂犬病的疫苗。

近年來，有不少研究單位及生產(chǎn)機構(gòu)用CTN-1 株在雞胚細胞和二倍體細胞上進行適應性傳代，也已取得實質(zhì)性進展［11-20］；還有機構(gòu)發(fā)明了以CTN-1 株為模板構(gòu)建的mRNA 人用狂犬病疫苗［40］。期待不同細胞基質(zhì)培養(yǎng)的、新型的CTN-1 株人用狂犬病疫苗早日上市，為實現(xiàn)早日消除狂犬病的目標而努力。