畢 博，臧圣奇，何懋典，穆 睿，于泓川，劉 鵑，李軍霞，陳 博，榮 亮，史小蕾，金 磊

0 引 言

近年來，基于生物材料的骨組織工程(bone tissue engineering，BTE)支架受到了廣泛的關(guān)注[1-4]。該生物支架材料不僅要有利于干細胞的黏附、增殖和分化，而且還要能與牙槽骨不同形態(tài)的缺損部分緊密貼合，確保口腔內(nèi)軟組織的良好愈合[5]。

殼聚糖(chitosan，CS)作為天然高分子化合物，具有來源廣泛、無毒、生物活性佳、生物相容性好、易降解等優(yōu)點。本實驗組前期已制備出孔徑適中及孔隙率合適的三維多孔殼聚糖/β-甘油磷酸鈉(CS/GP)支架，但仍存在機械性能不高、降解速率過快等問題[6-7]。近年來大量實驗表明可以通過將納米材料復(fù)合在原有支架上以提高其理化性能[8]。還原氧化石墨烯(reduced graphene oxide，rGO)是由氧化石墨烯(graphene oxide，GO)通過還原反應(yīng)得來，它作為石墨烯的衍生形式之一，具有較大的比表面積和優(yōu)秀的理化性能。rGO通過去除GO表面大多數(shù)的含氧基團以提高自身導(dǎo)電性能來促進干細胞生長[9]，而將rGO引入支架材料可提高原有支架的壓縮強度及彈性模量[10]。另外和GO相比，rGO可降低材料的水分散性，提高支架穩(wěn)定性并減少細胞毒性，具有更高的生物安全性[11]。

對于修復(fù)牙槽骨缺損，骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)作為BTE的標準細胞來源，需要從骨髓中取材，過程過于痛苦且獲得的細胞數(shù)量有限[12]。與BMSCs相比，人牙髓干細胞(human dental plup stem cells，hDPSCs)取材于第三磨牙或需拔除的健康牙齒的牙髓中，取材過程簡便易獲得。同時hDPSCs具有更高的自我更新能力和免疫調(diào)節(jié)能力，克隆形成能力和生長速率更高[13]。另有研究證明hDPSCs可促進動物牙周缺損的組織修復(fù)和人牙槽骨再生[14]?；谏鲜鰞?yōu)點，本實驗擬選用hDPSCs作為種子細胞。

綜上，本研究擬使用rGO對CS/GP支架進行修飾，通過表面形貌觀察、孔徑及孔隙率計算、機械性能檢測及對各組支架的吸水率和降解率分析，探究修飾CS/GP支架的合適濃度，再通過接種hDPSCs，探究引入rGO對復(fù)合支架細胞相容性的影響，從而綜合評價rGO修飾的CS/GP支架在牙槽骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

1.1.1 實驗試劑天然石墨粉、鹽酸(南京醫(yī)藥，中國)；L -抗壞血酸(L-AA)、殼聚糖、β-甘油磷酸鈉、溶菌酶(Sigma，美國)；PBS(Gibco，美國)。

1.1.2實驗儀器掃描電子顯微鏡(SEM，Hitachi S-3400N，日本)；透射電子顯微鏡(TEM，JEOL JEM-2100，日本)；傅里葉紅外光譜儀(FTIR，NICOLET NEXUS870，美國)；電子萬能試驗機(Instron 3365，美國)。

1.2實驗方法

1.2.1rGO的合成和表征采用化學(xué)還原法制備rGO，根據(jù)改良式Hummers法制備GO粉末[15]，將其超聲冰浴下分散到去離子水中，制備出3 mg/mL的GO分散液，按照質(zhì)量比為L-AA∶GO=10∶1將L-AA加入到分散液中，室溫下反應(yīng)48 h，再用去離子水將上述溶液洗滌至中性，通過冷凍干燥法制備出rGO粉末。將rGO粉末表面噴金后，掃描電鏡下觀察rGO表面形貌；將rGO粉末分散于無水乙醇中制成rGO分散液，再將分散液滴到碳支持膜銅網(wǎng)上，置于透射電鏡下觀察；采用KBr壓片法制樣，將rGO粉末進行傅里葉紅外光譜測試掃描范圍為500～4000 cm-1。

1.2.2rGO/CS/GP復(fù)合支架的制備根據(jù)本課題組前期實驗方法制備CS/GP復(fù)合支架作為對照組，并以此進一步制備 rGO/CS/GP復(fù)合支架。即將0.2 g CS(高溫高壓120 ℃，5 min)加入到9 mL 0.1 mol/L HCl內(nèi)連續(xù)攪拌2 h后，分別加入10、25和50mg的rGO粉末再持續(xù)攪拌1 h；將0.56 g β-甘油磷酸鈉加入到1 mL三蒸水中，超聲冰浴下反應(yīng)15 min，制成溶液后逐滴加入到rGO/CS分散液中，再放入37 ℃水浴箱內(nèi)反應(yīng)10 min使其呈凝膠狀態(tài)，最后真空冷凍干燥48 h，制得濃度分別為0.1%、0.25%和0.5%的rGO/CS/GP復(fù)合支架，另制備不含rGO的CS/GP支架作為對照。

1.2.3復(fù)合支架的理化性能檢測將4組支架進行相關(guān)性能檢測，綜合對比各項指標，選擇合適rGO濃度的復(fù)合支架進行后續(xù)細胞學(xué)實驗。①表面形態(tài)觀察，將支架切成直徑10 mm，高5 mm的圓柱形，表面噴金，SEM觀察各組樣品表面形貌，并根據(jù)比例尺測得各組支架的孔徑大小。②孔隙率，采用比重瓶法計算各組支架的孔隙率。支架質(zhì)量為W0，比重瓶內(nèi)裝滿無水乙醇的質(zhì)量為W1，將樣品完全浸沒入比重瓶內(nèi)，待排凈支架孔隙內(nèi)的氣泡后再次加滿無水乙醇，此時質(zhì)量記為W2，樣品取出后剩余無水乙醇和比重瓶的質(zhì)量記為W3，孔隙率P計算公式如下：

③吸水率，記錄干燥狀態(tài)下支架的質(zhì)量為W1，在37 ℃下浸泡在PBS中24 h，記錄支架濕重為W2，支架吸水率Wa計算公式如下：

④降解率，記錄支架的干燥狀態(tài)下重量為m0，將其放入含有10000 U/L溶菌酶的PBS溶液中，在37 ℃恒溫恒濕狀態(tài)下孵育，分別在孵育1、7、14、21 d后取出支架，用去離子水洗凈后40 ℃烘干，測得t時刻下干燥的支架重量為mt，降解率Dt計算公式如下：

⑤機械強度，采用電子萬能試驗機測量各組支架的壓縮強度，加載速率設(shè)置為2 mm/min，并繪制應(yīng)力應(yīng)變曲線，計算彈性模量結(jié)果，比較各組支架的力學(xué)性能。

1.2.4復(fù)合支架的細胞相容性檢測按照文獻所述培養(yǎng)hDPSCs[16]。將上述實驗中選取的合適濃度的rGO/CS/GP支架和CS/GP支架進行環(huán)氧乙烷滅菌(50 ℃，1 h)后置于24孔板中，浸泡在α-MEM培養(yǎng)基后放入37 ℃，5%CO2恒溫恒濕細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h備用。將生長活力佳、狀態(tài)良好的第3-4代hDPSCs按照每100 微升中1×105個細胞的細胞密度接種在兩組支架上，待6 h后補足10%FBS的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)7d，分別在第1、3、5、7天時移走培養(yǎng)基，每孔中加入300 μL MTS細胞增殖工作液，培養(yǎng)箱中孵育4 h，酶標儀490 nm處測得各組的吸光度A值。如上所述接種細胞并在第1、3、5、7天時乙醇梯度脫水、干燥支架后室溫下4%多聚甲醛固定20 min，洗滌液漂洗3次，5 min/次；每孔內(nèi)加入300 μL鬼筆環(huán)肽工作液于室溫下避光孵育1 h，洗滌液再次漂洗3次，5 min/次，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞在支架表面的黏附形態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1rGO的合成和表征真空冷凍干燥過的rGO呈黑色絮狀粉末，SEM下可見其出現(xiàn)明顯的片層結(jié)構(gòu)，周圍卷曲形成褶皺樣結(jié)構(gòu)，各層間相互交錯疊加。TEM下可更明顯地觀察到rGO的薄層結(jié)構(gòu)，呈半透明狀態(tài)，選區(qū)電子衍射圖可見明顯的六角衍射光斑。rGO的FTIR顯示經(jīng)過還原后，GO上的含氧官能團，如在1720cm-1的羰基C=O伸縮振動吸收峰完全消失，而3315cm-1的羥基O-H的振動吸收峰，1619cm-1吸附水分子的變形振動峰，1226cm-1環(huán)氧基C-O的伸縮振動峰和1060cm-1烷氧基C-O的伸縮振動峰的強度明顯減弱，這說明GO中大部分含氧基團被轉(zhuǎn)移，GO被還原。見圖1、圖2。

圖 1 鏡下觀察還原氧化石墨烯

圖 2 還原氧化石墨烯的傅里葉紅外光譜圖

2.2復(fù)合支架的表面形態(tài)將上述不同濃度的rGO/CS復(fù)合支架在掃描電鏡觀察可以發(fā)現(xiàn)，各組支架均呈現(xiàn)出三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。其中 CS/GP組支架的網(wǎng)狀骨架上較為平整；0.1%rGO/CS/GP組支架的個別網(wǎng)狀骨架上可見rGO片層附著其上，但是數(shù)量較少，不易發(fā)現(xiàn)；0.25%rGO/CS/GP組支架的大多數(shù)網(wǎng)狀骨架上均可觀察到rGO片層的附著，使大多數(shù)的網(wǎng)狀骨架上均呈現(xiàn)出褶皺狀態(tài)；0.5%rGO/CS/GP組支架則可以發(fā)現(xiàn)很多的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)有多數(shù)rGO片層堆疊，堵塞住許多原本的孔狀結(jié)構(gòu)。見圖3。

a、b: CS/GP；c、d: 0.1%rGO/CS/GP；e、f: 0.25%rGO/CS/GP；g、h: 0.5%rGO/CS/GP

2.3孔徑和孔隙率各組支架的孔徑大小相差無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)； 0.5%rGO/CS/GP組支架的孔隙率比CS/GP、0.25%rGO/CS/GP組低(P<0.05)。見圖4。

*P<0.05

2.4吸水率rGO的引入提高了復(fù)合支架的吸水率，且隨著rGO含量增加，吸水率也隨之增加，0.1%、0.25%、0.5%rGO/CS/GP吸水率(535.87%±13.21%、621.48%±15.99%、637.19%±11.73%)均高于CS/GP復(fù)合支架(343.98%±11.03%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5降解率隨著降解時間的延長，各組支架的降解率也不斷增加，呈逐漸上升趨勢。另外在相同降解時間時，復(fù)合支架的降解率隨著rGO含量的增加而漸漸下降。其中CS/GP復(fù)合支架的降解速率最快，在第7和21天時分別達到46.47%±3.13%和81.35%±0.85%，均高于其余含rGO組支架(P<0.05)。見圖5。

*P<0.05

2.6機械強度測定各組支架的應(yīng)力應(yīng)變曲線顯示隨著應(yīng)變逐漸增加，支架的應(yīng)力也逐漸加大，并且隨著支架內(nèi)rGO濃度的增加，復(fù)合支架的抗壓性能逐漸加大。同樣復(fù)合支架的彈性模量也隨著支架內(nèi)rGO含量的增加而相應(yīng)增加[CS/GP：(1.10±0.14)MPa；0.1% rGO/CS/GP：(1.24±0.21)MPa； 0.25% rGO/CS/GP：(1.47±0.21 )MPa；0.5%rGO/CS/GP：(1.87±0.25) MPa]，其中0.5%rGO/CS/GP復(fù)合支架的彈性模量高于CS/GP支架(P<0.05)。見圖6。

圖 6 各組支架的機械強度比較

2.7細胞相容性測驗MTS結(jié)果顯示隨著時間的延長，hDPSCs在兩組支架上均能進行有效地細胞增殖，但是0.25%rGO/CS/GP組的細胞增殖更為迅速，在第5天和第7天時，兩組間的增殖差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。激光共聚焦顯微鏡下觀察同樣發(fā)現(xiàn)兩組支架上的細胞肌動蛋白被染成亮紅色，在兩組支架上均附著良好，同時隨著時間的增加，兩組支架上的細胞數(shù)量也逐漸增加。但是在培養(yǎng)相同時間時，CS/GP支架上的細胞附著數(shù)量較少，0.25%rGO/CS/GP支架上的細胞更為密集的伸展、附著于支架小梁及孔壁上，這一現(xiàn)象在第5、7天時更加明顯，與MTS結(jié)果相印證。見圖7、圖8。

與CS/GP支架比較，*P<0.05

圖 8 兩組支架的鬼筆環(huán)肽染色

3 討 論

rGO可以由GO通過熱還原、電還原或化學(xué)還原等方法實現(xiàn)，其中最常見的還原劑是肼，但因其毒性較高而無法用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。L-AA是一種天然的抗氧化劑，無毒易獲得[17]，本研究選它作為GO的還原劑，經(jīng)SEM和TEM觀察可見rGO的薄而透明的片狀結(jié)構(gòu)，周圍卷曲形成褶皺。研究表明，L-AA可通過氧化還原反應(yīng)來與GO表面的含氧基團如羥基、環(huán)氧基結(jié)合形成氫鍵，并通過消除反應(yīng)進一步還原GO，使C=C共軛體系得到恢復(fù)，同時L-AA的氧化產(chǎn)物如古洛糖酸可以通過和rGO表面剩余的含氧基團結(jié)合來消除rGO層間的π-π堆積，提高rGO的自身穩(wěn)定性[18]。FTIR結(jié)果同樣證實了rGO的成功制備。

在本課題組前期制備的CS/GP支架中，β-GP是形成三維互連網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵因素。先前的研究報道，CS/GP交聯(lián)支架的形成原因可分為以下3種相互作用：①CS和β-GP通過氨基和磷酸基團之間的靜電引力；②CS鏈間氫鍵；③β-GP可增強CS間的疏水作用。當加入rGO后，除了上述三個相互作用外，在rGO/CS/GP系統(tǒng)中，rGO和CS之間同樣存在靜電吸引，氫鍵和疏水相互作用[10]。已有研究證實，CS和rGO之間的氫鍵及靜電相互作用可以在分子水平上誘導(dǎo)更為均勻的三維網(wǎng)絡(luò)分散系統(tǒng)[19]。

為了探究復(fù)合CS/GP支架的合適rGO濃度，根據(jù)相關(guān)文獻查閱及預(yù)實驗結(jié)果，本研究選擇分別將0.1%、0.25%和0.5%的rGO與原有支架進行結(jié)合。SEM結(jié)果顯示，0.1%rGO/CS/GP支架組的多孔骨架上rGO附著較少；0.5%rGO/CS/GP支架組的rGO附著較多，有部分堵孔發(fā)生；而0.25%rGO/CS/GP支架組的rGO能較為均勻的附著在孔壁表面，呈現(xiàn)出rGO特有的褶皺形態(tài)。這些褶皺增加了支架原本的比表面積，同時rGO表面的含氧基團也可提供更多的細胞結(jié)合位點從而促進細胞黏附[11]。其次，支架材料的孔徑和孔隙率也是評價支架性能的重要指標。單個孔徑大于100μm的三維多孔石墨烯材料為細胞附著提供了合適的表面積，且現(xiàn)已證實孔徑大小介于70～120μm內(nèi)的支架有利于促進各種類型的干細胞粘附和增殖，骨組織工程合適的支架孔隙率則介于50%～90%之間[20]。本研究制備的0.25%rGO/CS/GP組支架的孔徑為(113.19±46.85)μm，孔隙率為58.99%±25.19%，符合骨組織工程需求。較高的吸水率同樣有利于細胞的生長、粘附及增殖。當支架內(nèi)rGO濃度增加至0.25%時，吸水率為(621.48±15.99)%，較對照組相比有顯著提高。支架發(fā)揮作用的持續(xù)時間則取決于降解速率，因此支架的降解速度應(yīng)和宿主體內(nèi)形成新骨的時間相匹配。溶菌酶可以通過水解CS的糖苷鍵使其降解[21]。在溶菌酶溶液中浸泡21 d后0.25%rGO/CS/GP組支架的降解速率為64.72%±2.24%，低于CS/GP組支架的降解速率。這是由于rGO與CS間的相互作用，納米rGO片的引入提高了CS/GP支架抗降解的穩(wěn)定性。另一方面，復(fù)合支架的機械性能測試結(jié)果顯示，0.25% rGO/CS/GP組支架在發(fā)生50%形變時，應(yīng)力可達到0.29MPa，高于單純CS/GP支架的0.16MPa；彈性模量也從CS/GP組原有的1.10±0.14Mpa提高到(1.47±0.21)MPa。復(fù)合支架機械性能的提高歸因于rGO表面仍舊存在的少量-COOH和CS的-NH2之間的共價結(jié)合；同時rGO較大的比表面積和二維片層結(jié)構(gòu)也可能對CS的鏈狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生更大的幾何約束，因此即使rGO表面的含氧基團不多，它也能通過非共價結(jié)合以促進CS的大分子鏈間產(chǎn)生更緊密的機械互鎖[22]。

細胞在多孔支架內(nèi)均勻的分布同樣是細胞增殖、分化的有利條件[23]。MTS檢測表明隨著時間的增加，兩組支架上的hDPSCs均有所增加，但是0.25% rGO/CS/GP復(fù)合支架組的增殖更快；另外鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示隨著時間的增加，更多的細胞肌動蛋白被染成紅色。這可能與rGO具有優(yōu)異的導(dǎo)電性，在細胞生長過程中0.25% rGO/CS/GP復(fù)合支架可模擬生物電刺激從而促進細胞增殖有關(guān)[24]。另外rGO能有效降低活性氧對細胞的損害，從而提高細胞的增殖活力，減少細胞凋亡[25]。

綜上所述，本研究成功制備rGO，并將其引入CS/GP支架中，制備了不同濃度的rGO/CS/GP復(fù)合支架材料，通過對比各組支架表面形態(tài)、理化性能和細胞相容性檢測，0.25% rGO/CS/GP組支架可改善機械性能，提高原有支架的吸水率并降低降解速率，同時促進干細胞黏附和增殖，在骨組織工程領(lǐng)域表現(xiàn)出較大的潛力。