楊洋，張建珍，趙小明*

（1.山西大學(xué) 應(yīng)用生物學(xué)研究所，山西 太原 030006；2.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

0 引言

昆蟲是無脊椎動物中種類最大、數(shù)量最多的類群，其表皮具有天然屏障的功能能夠使蟲體適應(yīng)不同的環(huán)境條件[1]。昆蟲表皮脂類的結(jié)構(gòu)和含量是決定其在干燥高溫等逆境環(huán)境中能否生存的主要因素。此外，作為昆蟲表皮重要成分之一，脂類物質(zhì)在避免昆蟲體內(nèi)水分蒸發(fā)、防止外源物質(zhì)滲入和信息素合成等方面具有重要作用。然而，目前關(guān)于昆蟲表皮脂類合成機(jī)制尚不清楚。

昆蟲表皮的主要化學(xué)組分是幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)，此外，還有酚類和脂類等化學(xué)物質(zhì)。昆蟲表皮的脂類主要存在于上表皮中，是由真皮細(xì)胞、脂肪體和絳色細(xì)胞等參與合成的，合成的原料一部分來自食物中的脂肪酸。脂肪酸的合成在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生，從線粒體運(yùn)出的乙酰CoA開始，在乙酰CoA羧化酶（Acetyl-CoA-Carboxylase，ACC）的作用下，合成丙二酰CoA[2]。之后，在脂肪酸合成酶（Fatty acid sythetase，F(xiàn)AS）等作用下，在NADPH酶存在下催化丙二酰CoA轉(zhuǎn)化為棕櫚酸酯，隨后在脂肪酸延長酶（Elongases，Elo）和去飽和酶（Desaturases，desat）的催化作用下，合成長鏈乙酰輔酶A硫酯[3]。Desat在脂肪酸合成過程中起著十分重要的作用，其幾乎存在于所有生物中如藻類、真菌、植物和動物，且種類眾多，能夠催化脂酰輔酶A雙鍵的形成[4]。根據(jù)desat作用底物的不同，可以將其可分為2類：可溶性的?；??；d體（Acyl-ACP）蛋白和膜結(jié)合蛋白[5]，然而目前在昆蟲中關(guān)于desats的研究大多集中于信息素合成中的作用。

本文以飛蝗（Locusta migratoria）為研究對象，基于已報道的飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫和基因組序列，搜索獲得飛蝗desat家族基因cDNA序列，并對其特征進(jìn)行分析；通過熒光定量PCR技術(shù)檢測Lmdesats家族基因在五齡期飛蝗的時空表達(dá)模式；最后基于RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)分析Lmdesats家族基因的生物學(xué)功能，為基于表皮脂類合成關(guān)鍵基因的害蟲防治靶標(biāo)的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

試驗(yàn)蟲卵保存于本實(shí)驗(yàn)室昆蟲飼養(yǎng)室，在人工氣候箱孵化后轉(zhuǎn)移至潔凈的紗籠中（30 cm×30 cm×30 cm），在光周期為14L：10D，濕度為（40±10）%，溫度為（30±2）℃的條件下，以新鮮小麥幼苗和麥麩進(jìn)行飼喂，待長至五齡進(jìn)行不同組織、不同發(fā)育天數(shù)取材以及RNA干擾實(shí)驗(yàn)。

1.2 供試藥品

RNA提取試劑（RNAiso Plus）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑等購于大連寶生物公司（TaKaRa）；雙鏈RNA合成試劑盒購于Promega公司；膠回收試劑盒和Taq酶等購于天根公司（TIANGEN）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 飛蝗Desat家族基因cDNA序列獲得

基于飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，搜索獲得3個Desats基因cDNA序列。結(jié)合飛蝗基因組數(shù)據(jù)庫[6]，將獲得的Lmdesats基因cDNA序列與基因組序列進(jìn)行比對（http：//www.locustmine.org/viroblast/viroblast.php），分析Lmdesats基因的內(nèi)含子和外顯子序列，并將其分別命名為Lmdesat1，Lmdesat2和Lmdesat3。通過SMART網(wǎng)站分析Lmdesats編碼蛋白結(jié)構(gòu)域以及ExPASy網(wǎng)站進(jìn)行分子量與等電點(diǎn)預(yù)測，利用GENEDOC軟件與其它物種Desats進(jìn)行氨基酸多序列比對，最后利用TMHMM軟件分析其跨膜域。

1.3.2 Desats聚類分析

將Lmdesat1、Lmdesat2和Lmdesat3序列分別在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST分析并下載黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）、德國小蠊（Blattella germanica）、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、褐飛虱（Nilaparvata lugens）等不同昆蟲物種Desats氨基酸序列。利用MEGA6.0軟件中鄰接法（neighborjoining，NJ）將Lmdesats氨基酸序列與其同源序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，獨(dú)立分析1 000次，數(shù)值代表bootstrap估算值。

1.3.3 總RNA提取及Desat家族基因表達(dá)特性檢測

摘取發(fā)育整齊的五齡第6天飛蝗若蟲不同組織部位，包括體壁（IN）、前腸（FG）、中腸（MG）、后腸（HG）、胃盲囊（GC）、馬氏管（MT）、生殖腺（GD）、脂肪體（FB）和翅芽（WP），以及5齡每天（1-8天）翅芽或胃盲囊。利用RNA提取試劑提取不同組織和時期樣品總RNA并進(jìn)行定量（樣品稀釋成0.5 μg/μL），取1 μg總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成并進(jìn)行10倍稀釋。利用Primer5.0軟件設(shè)計Lmdesats基因和RPL32內(nèi)參基因的特異性表達(dá)引物（見表1，生工公司合成），利用熒光定量PCR方法檢測Lmdesats基因在不同組織和不同發(fā)育時期中的表達(dá)特性，熒光定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參考課題組方法進(jìn)行[7]。每個不同組織部位或發(fā)育日齡均由3頭試蟲組成一個重復(fù)，共計4個重復(fù)。以RPL32作為內(nèi)參基因，Lmdesats基因在不同組織部位或發(fā)育日齡的相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

表1 Lmdesats研究中使用的引物Table 1 Primers ofLmdesatsused in this study

1.3.4 基于RNAi的生物學(xué)功能分析

根據(jù)Lmdesat1，Lmdesat2和Lmdesat3基因序列設(shè)計并合成含有T7啟動子序列（表1中橫線部分）的RNAi引物（表1，生工公司合成），以5齡飛蝗cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測并利用膠回收試劑盒回收目的條帶。以1 μg回收產(chǎn)物作為模板，利用dsRNA合成試劑盒分別合成Lmdesat1，Lmdesat2和Lmdesat3基因dsRNA，同時合成綠色熒光蛋白基因（GFP）dsRNA作為對照，然后將合成的dsRNA定量并稀釋為2 μg/μL，電泳檢測其完整度。選取4齡第2天飛蝗若蟲（共28頭試蟲，雌雄各半）用微量注射器將LmdesatsdsRNA（dsLmdesat1，dsLmdesat2和dsLmdesat3）從飛蝗第2和3腹節(jié)連接處注入體腔，注射劑量為10 μg/頭。注射等量的dsGFP作為對照（共28頭試蟲，雌雄各半），24 h后利用1.3.3中RNA提取和熒光定量PCR方法檢測Lmdesats基因沉默效率（3頭試蟲組成一個生物學(xué)重復(fù)，共計4個生物學(xué)重復(fù)），余下飛蝗（對照組和處理組各16頭）正常飼養(yǎng)用于表型觀察。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

Lmdesats家族基因組織、時期和沉默效率的相對表達(dá)量均采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS中Tukey’s HSD進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05為差異顯著，字母（a，b，c，d和e）代表差異顯著性。采用Studentt-test方法進(jìn)行差異表達(dá)分析，*P＜0.05表示差異顯著，**P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飛蝗Desat家族基因特性分析

基于飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，搜索獲得3條脂肪酸去飽和酶desat家族基因cDNA序列，分別命名為Lmdesat1，Lmdesat2和Lmdesat3，并上傳 Genbank，其登錄號分別為MN863500，MN863501和MN863502。結(jié)合基因組數(shù)據(jù)分析，Lmdesat1，Lmdesat2和Lmdesat3分別含有5個，6個和6個外顯子（圖1A），開放閱讀框1242 bp，966 bp和1083 bp，編碼413，321和361個氨基酸。預(yù)測Lmdesat1，Lmdesat2和Lmdesat3蛋白的分子量分別為46.7，37.4和40.3 kDa，等電點(diǎn)分別為6.34，9.03，9.22。與果蠅desat蛋白類似，Lmdesat1和Lmdesat3均含有FA_desaturase結(jié)構(gòu)域，而Lmdesat2除了含有FA_desaturase結(jié)構(gòu)域外，還具有一個lipid_DES結(jié)構(gòu)域（圖1B）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Lmdesat1，Lmdesat2和Lmdesat3蛋白與果蠅desat蛋白類似均具有4個跨膜結(jié)構(gòu)域（圖1C），屬于膜結(jié)合蛋白類型的脂肪酸去飽和酶。

圖1 飛蝗Lmdesats基因結(jié)構(gòu)圖、編碼氨基酸結(jié)構(gòu)及跨膜域分析。A.飛蝗Lmdesats基因結(jié)構(gòu)圖；B.飛蝗Lmdesats編碼氨基酸結(jié)構(gòu)；C.飛蝗Lmdesats跨膜域分析Fig.1 Genomic structure，coding amino acid structure and transmembrane domain analysis ofLmdesats A.The genomic structure ofLmdesats；B.the coding amino acid structure ofLmdesats；C.the transmembrane domain analysis ofLmdesats

2.2 飛蝗Desat家族蛋白聚類和序列比對分析

在NCBI進(jìn)行BLAST分析并下載不同物種的同源desat氨基酸序列，進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示Lmdesat1，Lmdesat2和Lmdesat3分別與delta-9，delta-4和delta-11類型的脂肪酸去飽和酶聚為一支，并且具有較高的同源性（圖2）。利用Lmdesat1，Lmdesat2和Lmdesat3序列分別與果蠅、內(nèi)華達(dá)古白蟻（Zootermopsis nevadensis）、德國小蠊、赤擬谷盜、褐飛虱的desat序列進(jìn)行比對分析發(fā)現(xiàn)，Lmdesat1，Lmdesat2和Lmdesat3分別與delta-9，delta-4和delta-11類型的desat具有較高的相似性，其中Lmdesat2與 delta-4 類型的 Sphingolipid delta（4）-desaturase DES1同源性高達(dá)91%以上（圖3）。

圖2 Lmdesats與不同昆蟲物種間desats的系統(tǒng)聚類分析Fig.2 Phylogenetic analysis ofLmdesatsand desats from different insect species

圖3 Lmdesats與不同昆蟲去飽和酶desats多序列比對Fig.3 Multiple sequence alignments ofLmdesatsand desats from different insect species

2.3 飛蝗Desat家族基因在5齡不同組織部位和不同發(fā)育天數(shù)的表達(dá)

為了探討desats家族基因組織表達(dá)特性，根據(jù)已經(jīng)得到的Lmdesats基因cDNA序列，合成特異性的表達(dá)引物，利用熒光定量PCR分析了Lmdesat1，Lmdesat2和Lmdesat3在5齡第6天飛蝗若蟲的9個不同組織部位的表達(dá)。結(jié)果表明：Lmdesats組織表達(dá)具有多樣性，在多個組織中均有表達(dá)，如體壁（IN）、中腸（MG）、后腸（HG）、脂肪體（FB）、胃盲囊（GC）、生殖腺（GD）、馬氏管（MT）和翅芽（WP）（圖4），其中Lmdesat1在胃盲囊、生殖腺和體壁中高表達(dá)（圖4A），Lmdesat2在馬氏管和翅芽中高表達(dá)（圖4B），而Lmdesat3在胃盲囊、中腸、后腸和馬氏管中高表達(dá)（圖4C）。

圖4 熒光定量PCR檢測Lmdesats基因在5齡若蟲不同組織和不同發(fā)育天數(shù)的表達(dá)特性A-C.Lmdesats基因在5齡飛蝗不同組織部位的表達(dá)水平；D-F.Lmdesats基因在5齡飛蝗不同發(fā)育天數(shù)的表達(dá)水平Fig.4 Expression ofLmdesatsin different tissues and different days of the fifth instar nymphs ofL.migratoriaby qPCR analysisA-C.The mRNAlevel ofLmdesatsin different tissues of fifth instar nymphs ofL.migratoria；D-F.The mRNAlevel ofLmdesats in different days of fifth instar nymphs ofL.migratoria.

同樣方法對這3個基因在5齡期若蟲不同發(fā)育天數(shù)的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示：Lmdesat1和Lmdesat3在5齡第6天具有較高的表達(dá)而Lmdesat2在蛻皮前（第8天）高表達(dá)（圖4D-F）。

2.4 飛蝗Desat家族基因的生物學(xué)功能分析

將合成的dsLmdesats注射至5齡第2天飛蝗若蟲（10 μg每頭蟲），以注射等量的dsGFP為對照，正常飼養(yǎng)24 h后收集整蟲提取總RNA，利用熒光定量PCR技術(shù)分別檢測Lmdesat1，Lmdesat2和Lmdesat3基因的沉默效率。結(jié)果表明，與對照組相比，注射dsLmdesats組中Lmdesats的表達(dá)量顯著降低，沉默效率均在50%以上（圖5A，B和D）。表型觀察顯示，84.2%的注射dsLmdesat3的飛蝗無法蛻皮，在蛻皮前致死；42.8%的注射dsLmdesat1的飛蝗能夠正常發(fā)育，但羽化為成蟲后出現(xiàn)翅型紊亂的表型，而注射dsLmdesat2的飛蝗與對照組一樣未能出現(xiàn)可見表型，均能正常蛻皮、羽化（圖5C）。

圖5 注射dsRNA后對Lmdesats基因表達(dá)及飛蝗發(fā)育的影響A：Lmdesat1沉默效率檢測；B：Lmdesat2沉默效率檢測；C：Lmdesat1和Lmdesat2沉默后的表型圖；D：Lmdesat3沉默效率檢測和沉默后的表型圖Fig.5 Effects of dsLmdesatson the expression ofLmdesats and the development ofL.migratoria

3 討論

脂類是昆蟲表皮重要成分之一，其具有避免昆蟲體內(nèi)水分蒸發(fā)和防止外源物質(zhì)滲入的作用[8]。除此之外，脂類在昆蟲信息素合成、防御、生殖等方面同樣具有重要作用[9]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合表皮形態(tài)學(xué)和蛋白分離等生物化學(xué)技術(shù)，國內(nèi)外學(xué)者逐步開展了昆蟲表皮脂代謝關(guān)鍵酶基因的鑒定和功能解析，如脂肪酸合成酶基因FAS[10-11]，延伸酶基因 ELO[12-13]，還原酶基因 FAR[15]以及參與碳?xì)浠衔锖铣傻募?xì)胞色素P450（CPY4G）等[14-18]，然而昆蟲脂肪酸去飽和酶desat研究報道較少。Desat根據(jù)其結(jié)構(gòu)特性可分為可溶性?；?酰基載體蛋白和膜結(jié)合蛋白，研究報道可溶性Desat蛋白大多分布于植物質(zhì)體的基質(zhì)中[5]。膜結(jié)合蛋白根據(jù)其作用底物不同可以分為酰基輔酶A去飽和酶、‘front-end’-酰基輔酶A去飽和酶和脂酰脂去飽和酶[4]。本文識別的3個飛蝗desat均含有脂肪酸去飽和酶結(jié)構(gòu)域和4個跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于膜結(jié)合蛋白類型的脂肪酸去飽和酶。

昆蟲desat首先在果蠅被報道[19]，隨后發(fā)現(xiàn)該酶（Dmdesat1）具有Δ9功能特異性[20]。本文Lmdesat1與Dmdesat1聚為一支且具有較高相似性，同屬于Δ9類型的脂肪酸去飽和酶，可能具有類似的功能。Bonsquet等[21]研究發(fā)現(xiàn)Dmdesat1主要表達(dá)于果蠅脂肪體和絳色細(xì)胞，除此之外，在前腦中部、malpighi小管、直腸乳突、生殖系統(tǒng)組織（包括精囊、附腺和卵巢）中具有一定量的表達(dá)，表現(xiàn)出組織表達(dá)多樣性。Falcon等在意大利蜜蜂（Apis mellifera）表皮轉(zhuǎn)錄組中識別了6個在表皮中高表達(dá)的desat相關(guān)基因[22]。Badouin等在螞蟻（Formica exsecta）轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了6個Δ9 desat，可能在螞蟻間的信息交流中具有重要作用[23]。在家蠶（Bombyx mori）中鑒定到14個desats編碼蛋白，研究發(fā)現(xiàn)家蠶desat1和desat5～8具有Δ11酶活性，而desat3和desat4具有Δ9活性[24]。Haritos等從赤擬谷盜基因組中鑒定出15個Tcdesats基因，其中有8個編碼蛋白具有去飽和酶活性[4]。綜上所述，昆蟲desat家族蛋白在數(shù)量、類型和表達(dá)上均具有多樣性，并且大多具有去飽和活性。本文根據(jù)飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫和基因組數(shù)據(jù)獲得3個desat家族基因，分別屬于Δ4，Δ9和Δ11類型的去飽和酶，可能具有不同的活性。Lmdesats組織和時期表達(dá)同樣顯示出多樣性，暗示其可能具有不同的生物學(xué)功能。

在果蠅Dmdesat1突變體中，雌雄果蠅表皮不飽和烴含量顯著降低[20]，表明其在烴類合成中具有重要作用。除果蠅之外，目前關(guān)于昆蟲desat的研究大多集中在信息素合成中的作用。如Albre等[25]從4種卷葉蛾（leafroller）中鑒定到6個desats去飽和酶，研究發(fā)現(xiàn)其中2個Δ9和1個Δ10去飽和酶參與信息素的合成。Hagstrom等[26]在斜紋卷蛾（Ctenopseustis obliquana）中鑒定出一種desat7去飽和酶，該酶僅對豆蔻酸的Δ5具有去飽和功能。此外，在鱗翅目昆蟲玉米螟（Ostrinia）中，研究發(fā)現(xiàn)不同種間（亞洲玉米螟和歐洲玉米螟）的desat作用雙鍵位置不同（Δ11或Δ14），使產(chǎn)生的信息素種類也不相同[27]。本文利用RNAi方法研究發(fā)現(xiàn)Lmdesat2不影響飛蝗的正常生長發(fā)育，Lmdesat1影響成蟲翅的發(fā)育，而沉默Lmdesat3則影響若蟲的發(fā)育且80%以上若蟲致死，但其具體活性及作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為desats基因在昆蟲脂類物種合成中的功能研究提供了基礎(chǔ)，并為基于脂合成基因?yàn)榘袠?biāo)的害蟲防治奠定理論依據(jù)。